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Doctoral Thesis
2025
Investigating different Bacillus subtilis expression systems for recombinant enzyme production
Investigating different Bacillus subtilis expression systems for recombinant enzyme production
Abstract (English)
Enzymes play an indispensable role in the food industry by improving texture, color, shelf life, or nutritional value of food products. A prerequisite for the application of food enzymes is their high-yield and cost-effective production in a suitable host. The Gram-positive bacterium Bacillus subtilis is a promising host due to the organism's qualified presumption of safety status, its genetic accessibility, and short cultivation times. In addition, B. subtilis can efficiently secrete heterologous enzymes into the extracellular medium, which simplifies downstream processing.
This thesis explored different B. subtilis expression systems for the recombinant production and secretion of the β-galactosidase (EC 3.2.1.23) from Paenibacillus wynnii (β-gal-Pw) and the protein-glutamine glutaminase (EC 3.5.1.44) from Bacteroides helcogenes (PGB). Both enzymes have a potential application in the food industry. The β-gal-Pw offers favorable kinetic properties for application in lactose-depleted dairy products. The PGB is used to modify the techno-functional properties of proteins, thereby improving their application in food products. The first study investigated the secretion of the cytoplasmic 120 kDa β-gal-Pw using B. subtilis SCK6. Different expression conditions were tested to find proficient conditions for secretion. Codon-optimization of the native β-gal-Pw gene and cultivation temperature reduction from 37°C to 30°C increased secretory β-gal-Pw production. Furthermore, two promoters and four signal peptides were tested in multiple combinations. Signal peptides of the Sec-pathway and the Tat-pathway enabled efficient secretion, which, however, depended on the specific combination of promoter and signal peptide used. The highest extracellular
activity of 55 µkat/Lculture was achieved with the PaprE promoter and the Tat-signal peptide PhoD in shake flask cultivations. The subsequent bioreactor cultivation further improved secretory β-gal-Pw production by 1.4-fold and resulted in 21 mg/Lculture purified β-gal-Pw. The second study explored the intracellular β-gal-Pw production in the undomesticated strain B. subtilis 007. Great differences in production were observed by testing the PaprE and P43 promoter with each corresponding 5’ untranslated region (5’UTR). The use of the PaprE promoter led to an intracellular β-gal-Pw activity of 2515 µkat/Lculture, which was 45-fold
higher compared to the P43 promoter. Further modification of the core PaprE promoter or the spacer sequence in the 5’UTR did not improve β-gal-Pw production. The 5’UTR in the P43 construct was replaced with the aprE 5’UTR, which significantly improved mRNA stability. In addition, β-gal-Pw production was enhanced from 56 µkat/Lculture to 2756 µkat/Lculture. The crucial role of the 5’UTR and the corresponding mRNA stability was subsequently confirmed by producing the β-glucosidase from Pyrococcus furiosus and the cellobiose-2-epimerase from Caldicellulosiruptor saccharolyticus in B. subtilis 007. The third study focused on B. subtilis 007 for secretory and antibiotic-free PGB production. The genome of the undomesticated B. subtilis 007 was sequenced and provided the basis for multiple genomic integrations of the PGB expression cassette via CRISPR/Cas9. By selecting the specific integration sites, genes were simultaneously deleted to optimize the production strain and process. Four genes were targeted for the elimination of sporulation (sigF), foaming (sfp), motility (flgE), and α-amylase production (amyE). The first PGB expression cassette was integrated into sigF, which resulted in the expected asporogenic strain. An extracellular PGB activity of 4.1 µkat/Lculture was reached in bioreactor cultivations. The second expression cassette was integrated into sfp, which reduced foaming and increased the secretory PGB production by 1.3-fold. Since integration into the flgE locus did not enhance PGB production, the third PGB expression cassette was inserted into the amyE locus. The extracellular PGB activity of the respective strain was significantly increased from 5.4 µkat/Lculture to 9.5 µkat/Lculture.
Abstract (German)
Enzyme werden in der Lebensmittelindustrie vielfältig eingesetzt, um Textur, Farbe, Haltbarkeit oder den Nährwert von Lebensmitteln zu verbessern. Eine Voraussetzung für den Einsatz von Lebensmittelenzymen ist deren kostengünstige Herstellung mit hohen Ausbeuten und in einem geeigneten Produktionsorganismus. Das Gram-positive Bakterium Bacillus subtilis ist aufgrund seines qualified presumption of safety Status, seiner genetischen Zugänglichkeit und der kurzen Kultivierungsdauer besonders gut für die rekombinante Enzymproduktion geeignet. Darüber hinaus kann B. subtilis heterologe Enzyme effizient aus der Zelle sekretieren, wodurch die weitere Aufarbeitung vereinfacht wird. In dieser Arbeit wurden verschiedene B. subtilis Expressionssysteme für die rekombinante Produktion und Sekretion der β-Galactosidase (EC 3.2.1.23) aus Paenibacillus wynnii (β-gal-Pw) und der Protein-Glutamin Glutaminase (EC 3.5.1.44) aus Bacteroides helcogenes (PGB) untersucht. Beide Enzyme haben potenzielle Anwendungen in der Lebensmittelindustrie. Die β-gal-Pw besitzt vorteilhafte kinetische Eigenschaften für den Einsatz in laktosefreien Milchprodukten. Die PGB wird zur Veränderung der techno- funktionellen Eigenschaften von Proteinen eingesetzt, um deren Anwendung in Lebensmitteln zu verbessern. Die ERSTE STUDIE untersuchte die Sekretion der zytoplasmatischen 120 kDa β-gal-Pw mit B. subtilis SCK6. Um eine effiziente Sekretion zu ermöglichen, wurden verschiedene Expressionsbedingungen getestet. Die Codon-Optimierung des nativen β-gal-Pw Gens, sowie die Reduktion der Kultivierungstemperatur von 37°C auf 30°C steigerten die sekretorische β-gal-Pw Produktion. Zudem wurden zwei Promotoren und vier Signalpeptide in unterschiedlichen Kombinationen getestet. Die Sekretion der β-gal-Pw war sowohl mit Signalpeptiden des Sec-Weges und des Tat-Weges möglich, hing aber von der spezifischen Kombination aus Promotor und Signalpeptid ab. In Schüttelkolbenkultivierungen wurde die höchste extrazelluläre Aktivität von 55 μkat/LKultur mit dem PaprE-Promotor und dem Tat- Signalpeptid PhoD erreicht. Die anschließende Bioreaktorkultivierung verbesserte die sekretorische β-gal-Pw-Produktion weiter um das 1,4-fache und führte zu 21 mg/LKultur gereinigter β-gal-Pw. In der ZWEITEN STUDIE wurde die intrazelluläre β-gal-Pw-Produktion in dem undomestizierten Stamm B. subtilis 007 erforscht. Dabei zeigten sich große Unterschiede zwischen der Produktion mit dem PaprE- und P43-Promotor und den entsprechenden 5'- untranslatierten Regionen (5'UTR). Die Verwendung des PaprE-Promotors führte zu einer intrazellulären β-gal-Pw-Aktivität von 2515 μkat/LKultur, welche 45-mal höher war als mit dem P43-Promotor. Weitere Modifikation des PaprE-Promotors oder der Spacer-Sequenz in der 5'UTR verbesserten die β-gal-Pw-Produktion nicht. Durch den Austausch der 5'UTR im P43-Konstrukt mit der aprE 5'UTR wurde die mRNA- Stabilität deutlich verbessert wurde. Dies führte zu einer signifikanten Steigerung der β-gal- Pw-Produktion von 56 μkat/LKultur auf 2756 μkat/LKultur. Die stabilisierende Rolle der 5'UTR wurde anschließend durch die Produktion der β-Glucosidase aus Pyrococcus furiosus und der Cellobiose-2-Epimerase aus Caldicellulosiruptor saccharolyticus mit B. subtilis 007 bestätigt. Die DRITTE STUDIE untersuchte die sekretorische und antibiotikafreie Produktion der PGB mit B. subtilis 007. Die Genomsequenzierung von B. subtilis 007 bildete die Grundlage für die gezielte Mehrfachintegration der PGB-Expressionskassette mittels CRISPR/Cas9. Durch die gezielte Auswahl der Integrationsstellen wurden gleichzeitig Gene deletiert, um den Produktionsstamm und Produktionsprozess zu optimieren. Vier Gene wurden ausgewählt, um die Sporulation (sigF), Schaumbildung (sfp), Motilität (flgE) und α-Amylaseproduktion (amyE) zu eliminieren. Die erste PGB-Expressionskassette wurde in sigF integriert und führte zu einem nicht- sporulierenden Stamm. In den folgenden Bioreaktorkultivierungen wurde eine extrazelluläre PGB-Aktivität von 4,1 μkat/LKultur erreicht. Die zweite Expressionskassette wurde in sfp integriert, wodurch die Schaumbildung reduziert und die sekretorische PGB-Produktion um das 1,3-fache gesteigert wurde. Da die Integration in den flgE Lokus zu keiner Steigerung der PGB-Produktion führte, wurde die dritte Expressionskassette in amyE insertiert. Dadurch wurde die extrazelluläre PGB-Aktivität deutlich von 5,4 μkat/LKultur auf 9,5 μkat/LKultur erhöht.
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Faculty of Natural Sciences
Institute
Institute of Food Science and Biotechnology
Examination date
2025-06-27
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Senger, J. (2025). Investigating different Bacillus subtilis expression systems for recombinant enzyme production. https://doi.org/10.60848/12936
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English
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570 Biology
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Sustainable Development Goals
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author = {Senger, Jana},
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