Detektion von Schadhefen in Wein mittels mit Flusszytometrie analysierter in situ Hybridisierung (Flow-FISH)

Abstract

In oenological practice, mostly unpasteurised grape musts are used. This leads to an increased introduction of non-saccharomyces, which can have a lasting effect on the fermentation process. Disturbances in the fermentation process are usually only detected in practice on the basis of abnormalities in selected parameters such as sugar content or temperature or the occurrence of off-flavours. The fermenting yeast population may already be so affected at this point that intervention in the fermentation process can no longer prevent the occurrence of off-flavours in the end product or incomplete fermentation. With the help of flow cytometry, an efficient method using FISH (Fluorescence In Situ Hybridisation) was developed to detect and quantify the common representatives of the fermentation population such as Sacchoromyces cerevisiae and the harmful yeast population such as Hanseniaspora uvarum, Dekkera bruxellensis and Pichia anomala in the course of fermentation. Rapid detection enables countermeasures to be taken in good time before a harmful yeast population can have too great of an influence on the course of fermentation and the metabolites formed. Flow-FISH was established with pure cultures from strain collections in defined medium (YPD) and pasteurised white grape must. Samples are extracted and fixated directly from fermentation mixtures. For hybridisation, 18S- and 26S-rRNA probes with FITC-labelling are used. For the evaluation of the flowcytometric data, the Overton-subtraction method is used in this work. This allows a more accurate assessment of the hybridised cell population than the usual setting of a marker. For this purpose, an effective negative control with complementary sequence to the universal eukaryote probe (Euk516) is introduced. Subsequently, the method already known from the literature was optimised with regard to hybridisation conditions and cell fixation and thus adapted to the requirements of a quantitative flow cytometric analysis. With fixation in formaldehyde or in ethanol, fixation methods were developed that fulfil the requirements of both rapid and reliable fixation in the laboratory and rapid fixation in the cellar, if transport to the laboratory is not possible in a timely manner.Helper probes were designed to increase the fluorescence intensity. They are unlabelled and bind in the direct proximity of the specific probe. In all yeast species investigated, S. cerevisiae, H. uvarum, D. bruxellensis and P. anomala, the fluorescence intensity can be considerably increased by using the helper probes. In the case of D. bruxellensis and P. anomala, detection is only possible with the use of the helper probes. The helper probes allow the Flow-FISH assay to be used in a broader growth range of the yeast culture. Without helper probes, quantitative detection is limited to the middle logarithmic growth phase. With helper probes, hybridised cells can be reliably detected starting in the early logarithmic growth phase up until the stationary phase. This covers the critical phase of fermentative activity so that increasing contamination can be detected in the fermentation.The specificity of the probes is given. In part, there are slightly increased fluorescence intensities compared to the negative control, especially with the D. bruxellensis probe combination and non-specific yeasts, which can probably be attributed to increased binding due to the composition of this probe combination.The Flow-FISH assay is also reliable in mixtures of different yeast species and up to a cell count of 10³ cells / ml in the initial fermentation. This detection limit is also achieved by other methods in molecular biology for yeast detection. In contrast to most of these methods, Flow-FISH can also quantify the number of yeasts present. Additionally the use of the flow cytometer offers a simple variant to determine the total cell count of all yeasts in the fermentation. The detection limit of Flow-FISH allows detection before the damage threshold values of the yeasts examined are reached. The Flow-FISH method presented in this dissertation can also be applied to other yeast strains, some of which also originate from wild isolates. A transferability to native fermentations from oenological practice is given. It was possible to examine both spontaneous fermentations and inoculated fermentations in practice fermentations in steel tanks for their yeast population composition and to follow their development in the course of fermentation. Due to the use of flow cytometry and the helper probes and negative control used in this dissertation, the optimised Flow-FISH assay offers a stable basis for the continued development of a test system for use in oenological practice.

In der önologischen Praxis werden meist unpasteurisierte Moste verwendet. Dadurch kommt es zu einem vermehrten Eintrag von Nicht-Saccharomyceten, welche den Fermentationsprozess nachhaltig beeinflussen können. Störungen im Fermentationsprozess werden im Praxisbetrieb zumeist nur anhand von Auffälligkeiten ausgewählter Parameter wie Zuckergehalt oder Temperatur oder dem Auftreten von Fehltönen detektiert. Die fermentierende Hefepopulation kann zu diesem Zeitpunkt bereits so geschädigt sein, dass ein Eingreifen in die Fermentation das Auftreten von Fehltönen im Endprodukt oder eine unvollständige Fermentation nicht mehr verhindern kann. Mit Hilfe der Flusszytometrie wurde eine effiziente Methode entwickelt, um die gängigen Vertreter der Fermentationspopulation wie Saccharomyces cerevisiae und der Schadhefenpopulation wie Hanseniaspora uvarum, Dekkera bruxellensis und Pichia anomala im Fermentationsverlauf mittels FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) zu detektieren und quantitativ zu erfassen. Durch eine rasche Detektion können rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergriffen werden, bevor eine Schadhefenpopulation zu großen Einfluss auf den Fermentationsverlauf und die gebildeten Stoffwechselmetabolite nehmen kann. Die Etablierung der Flow-FISH wurde in definiertem Medium (YPD) und pasteurisiertem weißen Traubenmost mit Reinkulturen durchgeführt. Die Probenentnahme und Fixierung erfolgt direkt aus Fermentationsansätzen. Zur Hybridisierung werden 18S- und 26S-rRNA-Sonden mit FITC-Markierung eingesetzt. Für die Auswertung der flusszytometrischen Daten wird in dieser Arbeit die Methode der Overton-Subtraktion angewendet. Diese ermöglicht eine genauere Beurteilung der hybridisierten Zellpopulation als das übliche Setzen eines Markers. Dazu wird eine effektive Negativkontrolle mit komplementärer Sequenz zu der universellen Eukaryontensonde (Euk516) eingeführt. Anschließend erfolgte die Optimierung der bereits aus der Literatur bekannten Methode hinsichtlich Hybridisierungsbedingungen und Zellfixierung und somit ihre Anpassung an die Anforderungen einer quantitativen flusszytometrischen Analyse. Mit der Fixierung in Formaldehyd oder in Ethanol wurden Fixiermethoden entwickelt, die die Ansprüche an sowohl eine schnelle und zuverlässige Fixierung im Labor, als auch an eine rasche Fixierung im Keller, erfüllen. Zur Erhöhung der Fluoreszenzintensität wurden Hilfssonden entworfen. Diese sind unmarkiert und binden in direkter Nachbarschaft der spezifischen Sonde. Bei allen untersuchten Hefespezies S. cerevisiae, H. uvarum, D. bruxellensis und P. anomala kann durch den Einsatz der Hilfssonden die Fluoreszenzintensität deutlich gesteigert werden. Bei D. bruxellensis und P. anomala ist erst durch den Einsatz der Hilfssonden ein Nachweis möglich. Durch die Hilfssonden kann der Flow-FISH-Assay in einem breiteren Wachstumsbereich der Hefekultur eingesetzt werden. Ohne Hilfssonden ist die quantitative Detektion auf die mittlere logarithmische Wachstumsphase beschränkt. Mit Hilfssonden können schon in der frühen logarithmischen Wachstumsphase bis in die stationäre Phase hinein hybridisierte Zellen zuverlässig detektiert werden. Damit wird die kritische Phase der fermentativen Aktivität abgedeckt, um so zunehmende Kontaminationen in der Fermentation erkennen zu können. Die Spezifizität der Sonden ist gegeben. Zum Teil kommt es zu leicht erhöhten Fluoreszenzintensitäten gegenüber der Negativkontrolle vor allem mit der D. bruxellensis-Sondenkombination und dafür unspezifischen Hefen, die wahrscheinlich auf vermehrte Bindungen auf Grund der Zusammenstellung dieser Sondenkombination zurückzuführen sind.Der Flow-FISH-Assay ist auch in Mischungen verschiedener Hefespezies und bis zu einer Zellzahl von 10³ Zellen/ ml in der Ausgangsfermentation zuverlässig. Dieses Detektionslimit wird auch von anderen molekularbiologischen Methoden zur Hefedetektion erreicht. Im Gegensatz zu den meisten dieser Methoden kann die Flow-FISH auch die Anzahl der vorhandenen Hefen quantifizieren. Der Einsatz des Flusszytometers ermöglicht zusätzlich eine einfache Variante die Gesamtzellzahl aller Hefen in der Fermentation zu ermitteln. Das Detektionslimit der Flow-FISH ermöglicht eine Detektion bevor die Schadschwellenwerte der untersuchten Hefen erreicht sind. Die in dieser Arbeit vorgestellte Flow-FISH-Methode ist auch bei anderen Hefestämmen, die teilweise auch aus Wildisolaten stammen, anwendbar. Eine Übertragbarkeit auf native Fermentationen aus der önologischen Praxis ist gegeben. Es gelang sowohl Spontanfermentationen als auch inokulierte Fermentationen in Praxisgärungen im Stahltank auf ihre Hefepopulationszusammensetzung hin zu untersuchen und ihre Entwicklung im Laufe der Fermentation zu verfolgen.Der optimierte Flow-FISH-Assay bietet durch den Einsatz der Flusszytometrie und der in dieser Arbeit verwendeten Hilfssonden und Negativkontrolle eine stabile Basis zur weiteren Entwicklung eines Testsystems für den Einsatz in der önologischen Praxis.