Effects of diets with different phosporus availability on the intestinal microbiota of chickens and pigs

Abstract

In the research works of the present thesis, 16S rRNA gene sequencing and metaproteomics were employed to investigate the gut microbiota of chickens and pigs kept at experimental diets with varying amount of calcium-phosphorus (CaP) and supplemented MP. This represents a valuable approach to investigate the bacterial specimens involved in the P absorption, allowing for a comprehensive understanding of how the intestinal bacteria adapt to a new diet and which metabolic routes are affected by changing levels of supplemented P and/or MP. Two major experimental trials were performed during the investigation. The first one was conducted on chickens operating a modulation in the dietary levels of Ca, P and MP. This trial highlighted a shift in the composition of the crop and ceca-associated microbial community depending on the composition of the diet fed. Also, investigated protein inventory revealed that the stress condition due to the reduced P availability is mirrored in the gastrointestinal tract (GIT)-associated microbiota. Marked differences were observed in the functions of the bacterial community in the case of P-available diets versus P-deficient ones. Protein repertoire of the first case draws a thriving microbial community focused on complex and anabolic functions. Contrariwise, the bacterial community in the case of P-lacking diets appears to deal with catabolic functions and stress response. The second trial was conducted on pigs and attempts to define the dynamics featuring the microbiota adaptation to a new challenging diet composed of different protein sources and varying levels of Ca and P. Statistical evidences reveal a stepwise adaptation of the fecal microbiota to the experimental diets fed. Both DNA-based approach and metaproteomics independently reveal three main adaptation phases: -before the feeding of the experimental trial (i.e. Zero), -the response of the microbial community to the challenging factor (i.e. MA) and, finally, - the newly achieved homeostatic balance (i.e. EQ). As observed in the first trial, feeding of the experimental diets impairs the overall fecal microbiota composition, stimulating the presence of phase-specific bacterial specimens and a characteristic relative abundance of the shared ones. Bacterial families responsible for the phase-specific architecture of the fecal microbiota are also active in the biochemical pathways driving the functional peculiarities of each adaptation phase. A deeper investigation of the identified protein repertoire revealed that the observed statistical differences among the adaptation phases are uniquely due to the Ca and P composition of the diets fed. None of the observed effects can be attributed to the diverse protein sources supplemented with the diets. Functional categorization of the identified protein inventory depicts three diverse functional assets of the microbial community. Specifically, prior the feeding of the experimental diets, bacteria are hypothesized to live under homeostatic condition, since they appear to be involved in complex and highly-specialized functions. Following the administration of the experimental diets microbial community changes its functional priority and reduce the expression of highly specialized functions to focus on more essential ones. Proteins involved in complex functions such as widening the substrates array and facing complex sugars tend to increase in abundance while the new homeostatic balance is achieved. Altogether, data from both trials provide useful information for future studies aimed to design effective breeding strategies finalized to reduce the P supplementation in the routinely breeding of livestock and maintain a balanced microbial activity in the animal GIT. Investigation of the dynamics of the porcine microbiota provides instructions on the minimal exposure time required from the intestinal microbiota to adapt to a new dietary composition. This is of fundamental importance for the design of future studies aimed to confirm and/or continue our results. Moreover, the anatomical and physiological similarities occurring between humans and pigs, make our findings of interest for future human nutritional studies, where the mechanisms and lasts of the microbiota adaptation process is still object of discussion.

In den Forschungsprojekten der vorliegenden Arbeit wurden die 16S rRNA Gensequenzierung und Metaproteomik zur Untersuchung der Darmmikrobiota von Hühnern und Schweinen verwendet. Dabei wurde der Einfluss von Versuchsdiäten mit unterschiedlichen Mengen an Calcium-Phosphor (CaP) und ergänzten MP untersucht. Dies ist ein wertvoller Ansatz zur Identifizierung von Bakterienspezies, welche an der P-Absorption beteiligt sind, und ermöglicht es ein umfassendes Verständnis darüber zugewinnen, wie sich die Darmbakterien an eine neue Ernährung und an Stoffwechselwege, die von sich verändernden Mengen an ergänztem P und / oder MP beeinflusst werden, anpassen können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei große experimentelle Studien durchgeführt. Die erste Studie wurde an Hühnern durchgeführt und basierte auf der Verabreichung unterschiedlicher Mengen an Ca, P und MP in der Nahrung. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten eine Nahrungs-abhängige Verschiebung in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft in Kropf und Blinddarm. Außerdem zeigte das untersuchte Proteinrepertoire, dass der Stresszustand, aufgrund der reduzierten P-Verfügbarkeit, sich in der Mikrobiota im Gastrointestinaltrakt (GIT) widergespiegelt. Der Vergleich von Diäten mit verfügbarem P mit P-armen Diäten zeigte deutliche Unterschiede in den Funktionen der Bakteriengemeinschaft. Bei einer Diät mit verfügbarem P in der Nahrung, deutet die Analyse des Proteinrepertoires auf eine florierende mikrobielle Gemeinschaft hin, in der komplexe und anabole Funktionen vorherrschen. Im Gegensatz dazu scheinen bei Diäten mit P-Mangel katabole Funktionen und Stressreaktionen in der bakteriellen Gemeinschaft zu überwiegen. Die zweite Studie wurde an Schweinen durchgeführt und versuchte die Dynamik zu definieren, mit der sich die Mikrobiota an eine neue, herausfordernde, aus verschiedenen Proteinquellen und unterschiedlichen Mengen an Ca und P bestehende Nahrung, anpasst. Statistische Beweise zeigen eine stufenweise Anpassung der fäkalen Mikrobiota an die verabreichten Versuchsnahrung. Sowohl DNA- als auch metaproteomische Analysen, die getrennt voneinander durchgeführt wurden, zeigen drei Hauptanpassungsphasen, welche die folgenden experimentalen Adaptationsgruppen definieren: - vor der Verabreichung der Versuchsdiät (d.h. Null), - die Reaktion der mikrobiellen Gemeinschaft auf den herausfordernden Faktor (d.h. MA) und schließlich, - das Stadium des neu erreichten homöostatischen Gleichgewichts (d.h. EQ). Wie im ersten Versuch beobachtet wurde, beeinträchtigt die Fütterung der Versuchsnahrung die gesamte Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota, sie stimuliert das Vorhandensein von phasenspezifischen Bakterienarten und eine charakteristische relative Häufigkeit der phasenunspezifischen Bakterien. Bakterielle Familien, die für die phasenspezifische Struktur der fäkalen Mikrobiota verantwortlich sind, sind auch in den biochemischen Pfaden aktiv und sind im Wesentlichen für die funktionellen Besonderheiten jeder Anpassungsphase verantwortlich. Eine tiefere Untersuchung des identifizierten Proteinrepertoires ergab, dass die beobachteten statistischen Unterschiede zwischen den Adaptationsphasen eindeutig auf die Ca- und P-Gehalte der gefütterten Diäten zurückzuführen sind. Keine der beobachteten Effekten kann den verschiedenen gleichzeitig verabreichten Proteinquellen zugeschrieben werden. Die funktionelle Kategorisierung des identifizierten Proteinbestands zeigt drei verschiedene funktionelle Aspekte der mikrobiellen Gemeinschaft. Insbesondere wird angenommen, dass vor dem Füttern der experimentellen Diäten, die Bakterien unter homöostatischen Bedingungen leben, da sie in komplexe und hochspezialisierte Funktionen involviert zu sein scheinen. Nach der Verabreichung der experimentellen Diäten ändert die mikrobielle Gemeinschaft ihre funktionelle Priorität und reduziert die Ausübung hochspezialisierter Funktionen, um sich auf die wesentlichen zu konzentrieren. Während das neue homöostatische Gleichgewicht erreicht wird, nimmt die Menge an Proteinen, die an komplexen Funktionen beteiligt sind, wie z. B. die Verarbeitung einer großen Substratvielfalt sowie die Metabolisierung von komplexen Zuckern, zu. Zusammengefasst, liefern die aus beiden Experimente gewonnenen Daten nützliche Informationen für zukünftige Studien mit dem Ziel, effektive Zuchtstrategien zu entwickeln, um die P-Supplementierung bei der routinemäßigen Viehzucht zu reduzieren und eine ausgewogene mikrobielle Aktivität im Gastrointestinaltrakt des Tieres aufrechtzuerhalten. Die Untersuchung der Anpassungsdynamik der Schweinemikrobiota liefert genaue Informationen darüber, wie lange die intestinale Mikrobiota benötigt, um sich an eine neue Nahrungszusammensetzung anzupassen. Dies ist von zentraler Bedeutung für die Gestaltung zukünftiger experimenteller Studien, die darauf abzielen, unsere Ergebnisse zu bestätigen und/oder unsere Forschung fortzusetzen. Aufgrund der anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten, die zwischen Menschen und Schweinen auftreten, sind die erhaltenen Befunde auch für zukünftige Ernährungsstudien am Menschen von Interesse, bei denen die Mechanismen und die Dauer der Adaptationsprozesse der Mikrobiota noch untersucht werden.