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Abstract (English)
The evolutionarily conserved YidC/Oxa1/Alb3 family of proteins catalyzes the insertion of integral membrane proteins in bacteria, mitochondria, and chloroplasts. In this work Tth-IM60 from Thermus thermophilus was identified as a member of this family. The function and structure of the protein was analysed in detail.
Complementation studies in a Escherichia coli YidC-depletion strain show a functional replacement of the essential YidC by Tth-IM60 in vivo. A heterologous expression of the his-tagged Tth-IM60 protein was achieved in the E. coli strain C43 and pMS as a plasmid vector. It was shown that Tth-IM60 protein is located in the inner membrane probably in a dimeric state. After purification the protein tends to oligomerize in a higher, but very stable oligomeric state. The Tth-IM60 oligomeric protein was stable for 50 days at least. By size-exclusion chromatography the zwitterionic detergent LDAO and a buffer containing 20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl and 10 % glycerol were identified as the best conditions for purification and stability. With this buffer, Tth-IM60 was purified as a dimer via its C-terminal histag by two Ni-IMACs (immobilized metal affinity chromatography) and a size-exclusion chromatography. A final protein concentration up to 10 mg/ml was feasible. The purified Tth-IM60 protein was used for functional and structural studies. A weak binding of Tth-IM60 to the first periplasmic loop of SecF as shown by pulldown assays, suggests a Sec-dependent function of Tth-IM60. In addition, the essential Sec-independent function of Tth-IM60 was demonstrated by the translocation of the YidC substrate Pf3 coat into Tth-IM60 proteoliposomes. Moreover, the results of the single molecule spectroscopy measurements implicate that the translocation of Pf3 coat proteins occurs with a fast kinetics within 5 minutes.
The secondary structure of the Tth-IM60 protein was analysed by circular dichroism spectroscopy: 49 ? 55 % alpha-helical, 13 - 14 % beta-sheet, 14 ? 17 % beta-turns and 18 - 21% unordered structures were calculated. Tth-IM60 comprises more alpha-helical structures, but less beta-sheets than YidC, probably because of the first periplasmic loop of Tth-IM60 being shorter. The melting point of Tth-IM60 was determined to 68 °C, which is 10 degrees higher than the melting point of YidC. Furthermore, the Tth-IM60 protein was crystallized and X-ray analysis was performed. However, due to the low resolution the structure of the Tth-IM60 protein could not be determined so far.
The second part of this thesis concerns the ?translocating chain-associated membrane? (TRAM) protein. The TRAM protein is involved in the insertion of integral membrane proteins of the endoplasmic reticulum (ER) together with the Sec61-complex. In contrast to the Sec-components, no homologous YidC protein exists in the ER-membrane. Therefore, it was postulated that TRAM and YidC could have functional similarities. For functional studies the TRAM protein from X. laevis was expressed in E. coli as a fusion protein with a N-terminal MBP (maltose-binding protein) and a C-terminal histag. TRAM was purified via two different affinity matrices: Ni sepharose and an amylose resin. It was possible to reconstitute the fusion protein into liposomes. However a translocation of the YidC-substrate Pf3 coat into these proteoliposomes was not detectable. In addition, complementation studies with a YidC-depletion strain did not show that the essential YidC function can be replaced by TRAM in vivo.
Abstract (German)
Die Proteine der evolutionär konservierten YidC/Oxa1/Alb3-Familie sind an der Insertion von integralen Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein Tth-IM60 aus Thermus thermophilus als Mitglied dieser Familie identifiziert, sowie funktionell und strukturell näher charakterisiert.
So konnte mit Komplementationsstudien, die in vivo mit einem Escherichia coli YidC-Depletionsstamm durchgeführt wurden, gezeigt werden, dass Tth-IM60 das YidC Protein funktionell ersetzen kann. Außerdem konnte Tth-IM60 heterolog in E. coli C43 Zellen im pMS-Vektor mit einem C-terminalen His-tag exprimiert werden. Bei der Solubilisierung zeigte sich, dass das Protein in der Zelle vermutlich als Dimer vorliegt, allerdings nach der Reinigung dazu tendiert in einen höheren Oligomerzustand überzugehen, der nicht spezifiziert werden konnte. In diesem Zustand ist das Protein jedoch für mindestens 50 Tage sehr stabil. Mit Hilfe von Größenausschluss-chromatographien konnten das zwitterionische Detergenz LDAO und der Puffer aus
20 mM TrisHCl pH 8,5, 500 mM NaCl und 10 % Glyzerin als optimal für die Stabilität und Reinigung identifiziert werden. In diesem Puffer gelang es, das Protein über zwei Affinitäts- und eine Gelfiltrationschromatographie als Dimer zu reinigen und eine Konzentration von 10 mg/ml Protein als Voraussetzung für projektierte Kristallisations-versuche zu erreichen.
Mit in vitro Pulldown-Assays konnte eine schwache Bindung zwischen Tth-IM60 und der ersten periplasmatischen Domäne von SecF nachgewiesen werden, die auf eine Sec-abhängige Funktion von Tth-IM60 schließen lässt. Des Weiteren konnte die als essentiell beschriebene Sec-unabhängige YidC-Funktion durch die Translokation des YidC-Substratproteins Pf3 coat in Tth-IM60 Proteoliposomen mittels Einzelmolekül-spektroskopie nachgewiesen werden. Kinetische Versuche ließen darauf schließen, dass die Translokation von Pf3 coat Protein innerhalb von fünf Minuten abgeschlossen ist.
Strukturanalysen von Tth-IM60 mittels Zirkulardichroismusspektroskopie zeigten einen Anteil von 49 ? 55 % alpha-Helix, 13 - 14 % beta-Faltblatt, 14 ? 17 % beta-Schleife und 18 - 21% ungeordnete Sekundärstruktur. Im Vergleich zu YidC besitzt Tth-IM60 einen deutlich höheren alpha-helikalen und einen niedrigeren beta-Faltblatt Anteil, der mit dem deutlich kürzeren periplasmatischen Loop erklärbar ist. Der Schmelzpunkt von Tth-IM60 liegt bei 68 °C und ist damit um 10 °C höher als der von YidC. Außerdem gelang es, das
Tth-IM60 Protein zu kristallisieren und erste Diffraktionstests durchzuführen. Aufgrund der bislang zu geringen Auflösung konnte die Struktur jedoch noch nicht abschließend aufgeklärt werden.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit konnte auch das ?translocating chain-associated membrane? (TRAM) Protein aus X. laevis in E. coli C43 als Fusionsprotein mit N-terminalem MBP (Maltosebindeprotein) und C-terminalem His-tag heterolog exprimiert werden. Dieses Protein ist zusammen mit dem Sec61-Komplex an der Insertion von integralen Membranproteinen im Endoplasmatischen Retikulum (ER) beteiligt. Im Gegensatz zu den Sec-Komponenten gibt es im ER jedoch kein homologes YidC Protein. Daher könnten funktionelle Ähnlichkeiten zwischen TRAM und YidC existieren. Das TRAM Protein konnte mittels zweier verschiedener Affinitätschromatographien (IMAC und Amylose) gereinigt und anschließend in Liposomen rekonstituiert werden. Translokationsstudien mit Pf3 zeigten eine sehr schwache Bindung und sehr geringe Einbausignale, vergleichbar mit Liposomen. Auch in vivo Komplementationsstudien zeigten keine funktionelle Aktivität von TRAM, die YidC in E. coli ersetzen kann. Nach diesen Ergebnissen konnte dem TRAM Protein keine YidC vergleichbare zelluläre Funktion zugewiesen werden.
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Faculty
Faculty of Natural Sciences
Institute
Institute for Microbiology
Examination date
2011-04-28
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ISSN
ISBN
978-3-8439-0155-0
Language
German
Publisher
Publisher place
Classification (DDC)
570 Biology
Collections
Original object
Standardized keywords (GND)
Sustainable Development Goals
BibTeX
@phdthesis{Meyer2011,
url = {https://hohpublica.uni-hohenheim.de/handle/123456789/5527},
author = {Meyer, Susanne H.},
title = {Tth-IM60, eine Membraninsertase aus Thermus thermophilus},
year = {2011},
school = {Universität Hohenheim},
}