Axes determination in the frog Xenopus laevis : the function of the goosecoid, myo1d and dmrt2

Abstract

During early embryogenesis, pattern formation processes along the head-trunk (anteroposterior, AP), belly-back (dorsoventral, DV) and left-right (LR) body axis generate the fundamental body plan of the bilateria. The formation of the LR axis is exceptional because externally our body is bilateral symmetric whereas most inner organs are shaped and positioned asymmetrically. The three body axes are basically specified during gastrulation and neurulation by a set of developmental control genes. The aim of this work was to analyze the function of the highly conserved genes, goosecoid (gsc), myosin1d (myo1d) und dmrt2 during body axis determination in Xenopus. The first chapter of this work describes the activity of the homeobox transcription factor Goosecoid during AP- and DV-axis formation. Gsc acts as an autoregulatory transcriptional repressor and importantly is expressed in the Spemann Organizer (SO) of all vertebrate embryos. The SO represents the main dorsal signaling center for primary axis induction, regulates embryonic patterning and cell movements. It is further required for AP i.e. head and trunk development. Transferring of SO or gsc misexpression to ventral half of embryos resultes in secondary axis formation i.e. siamnese twins. However, SO function of Gsc was enigmatic, as gsc mutants showed no defects on early developmental processes what challenged Gsc function in the SO. In this chapter, gsc was characterized by conducting gain of function experiments in the embryonic midline of Xenopus embryos. Gsc was able to repress planar cell polarity (PCP) in a cell- and non-cell autonomous fashion leading to neural tube closure defects. In the early gastrulae, Gsc separates the head from the trunk mesoderm by repressing the mesodermal t-box gene transcription factor T (Tbxt). This inhibition allows the migration of the head mesodermal cells whereas the trunk notochord elongates by mediolateral intercalation. Gsc activity on PCP signaling seems to be specific for vertebrates only and correlates with the presence of two novel domains. The determination of the LR body axis is discussed in the second chapter of this work. At the so called left-right organizer (LRO) a cilia-mediated leftward-fluid flow initiates the symmetry breaking event in neurulae embryos. Lateral sensory cells (sLRO) of the LRO perceive flow on the left side and translate it into the left asymmetric induction of the highly conserved Nodal cascade. If and how the unconventional, actin-associated motor protein Myosin1d (Myo1d) as well as the transcription factor Doublesex and mab-3 related 2 (Dmrt2) intervene in LR specification was analyzed in this chapter. In evolutionary terms the study of myo1d was of high interest because in Drospohila, which lacks a ciliary flow mechanism, the homologous gene, myo31df, controls LR axis determination. Manipulations of myo1d in Xenopus demonstrated that in vertebrates Myo1d is involved in the cilia-based symmetry breakage event. By interacting with the PCP signaling pathway, Myo1d ensures leftward-fluid flow by regulating ciliary outgrowth and polarization. In Drosophila and Xenopus Myo1d interacts with PCP signaling and seems to link an ancestral symmetry breaking mechanism of the fly to the newly evolved leftward-fluid flow in vertebrates. Based on studies in zebrafish, which identified Dmrt2 as another factor involved in LR development and somitogenesis, we started the analysis of dmrt2 in Xenopus. Somitogenesis and laterality determination which on first sight are functionally distinct processes were analyzed in the context of dmrt2 function. In Xenopus, flow-sensing cells are affiliated to the somitic cell lineage and therefor paraxial mesoderm specification is crucial for setting up a functional LRO. Dmrt2 specifies the paraxial mesoderm and especially the sLRO by inducing the myogenic transcription factor myf5 in early gastrulae. This demonstrated for the first time experimentally how somitogenesis and laterality determination are intertwined and describes the genesis of the Xenopus sLRO cells in more detail.

Während der frühen Embryogenese generieren embryonale Musterbildungsprozesse entlang der Kopf-Rumpf- (anteroposterior, AP), Rücken-Bauch- (dorsoventral, DV) und links-rechts (LR) Körperachse den grundlegenden Bauplan der Bilateria. Hierbei ist vor allem die Ausbildung der LR-Achse auffallend: sie besticht durch eine äußerlich sichtbare Symmetrie entlang der AP-Achse, wohingegen die asymmetrische Formgebung und Position der inneren Organe in der sekundären Leibeshöhle äußerlich nicht zu erkennen ist. Die Ausbildung der drei Körperachsen wird durch die Aktivität zahlreicher Gene während der Gastrulation und Neurulation reguliert. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der hoch konservierten Gene goosecoid (gsc), myosin1d (myo1d) und doublesex-and mab3 related transcription factor 2 (dmrt2) während der Ausbildung der Körperachsen in Xenopus laevis näher zu untersuchen. Das erste Kapitel dieser Arbeit befasst sich mit der frühen Funktion des Homöobox-Transkriptionsfaktors Goosecoid während der Ausbildung der AP- und DV-Achse. Gsc wirkt als autoregulatorischer transkriptioneller Repressor, wird im Spemann-Organisator, dem Signalzentrum der primären Achseninduktion exprimiert und steuert die embryonale Musterbildung. Es reprimiert ventrale Signalwege im dorsalen Gewebe, separiert das Kopf- vom Chordamesoderm und reguliert Zellbewegungen im Zuge der Gastrulation und Neurulation. Die frühe Funktion von gsc im Spemann-Organisator war bislang enigmatisch, da der Funktionsverlust von gsc die frühe embryonale Entwicklung nicht beeinträchtigte. Durch gezielte Überexpression von gsc in der dorsalen Mittellinie von Xenopus Embryonen wurde hier die frühe Funktion von gsc näher charakterisiert. Gsc agierte sowohl zell- als auch nicht-zell-autonom als Repressor planarer Zellpolarität (planar cell polarity, PCP). In der frühen Gastrula separierte Gsc durch die Repression des mesodermalen T-box Gen Transkriptionsfaktors T (Tbxt) das Kopf- vom Chordamesoderm. Dies ermöglichte das migrieren des Kopfmesoderms und beschränkte die durch Tbxt-induzierte PCP-vermittelte mediolaterale Interkalation auf das elongierende Notochord des Embryos. Diese Funktion von Gsc scheint sich im Zuge der Evolution durch die Etablierung zweier neuer, für Vertebraten spezifische Domänen etabliert zu haben. Das zweite Kapitel befasst sich mit der Determinierung der LR-Körperachse in Xenopus, die als letzte der drei Körperachsen festgelegt wird. Diese wird durch einen Cilien-basierten nach links-gerichteten Flüssigkeitsstrom innerhalb des sog. links-rechts Organisators (LRO) in der Neurula initiiert. Die lateralen, linken sensorischen Zellen des LROs (sLRO) perzipieren den Flüssigkeitsstrom und translatieren dieses Signal in die Induktion der hoch konservierten Nodal Kaskade auf der linken Seite. Welche Funktion das unkonventionelle, Aktin-assoziierte Motorprotein Myo1d und der Transkriptionsfaktor Dmrt2 bei diesem Prozess einnimmt, wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Die Analyse von myo1d war hierbei evolutionär von großer Bedeutung, da das homologe Gene myo31df in Drosophila die Entstehung der LR-Achse, unabhängig eines links-gerichteten Flüssigkeitsstrom und einer asymmetrischen Gen-Kaskade reguliert. Die Manipulation von myo1d in Xenopus demonstrierte, dass die Funktion von Myo1d konserviert ist und auch in Vertebraten für den Symmetriebruch benötigt wird. Durch Interaktion mit dem PCP Signalweg trägt Myo1d über die Polarisierung und Ausbildung der Cilien zum links-gerichteten Flüssigkeitsstrom und somit zur Lateralitätsdeterminierung in Xenopus bei. Durch den Einfluss von Myo1d auf die PCP in Drosophila und Xenopus stellt Myo1d eine direkte Verbindung zwischen dem ancestralen Mechanismus und des in Vertebraten neu-evolvierten Flüssigkeitsstrom zum Bruch der bilateralen Symmetrie dar. Studien aus dem Zebrabärbling identifizierten Dmrt2 als einen weiteren Faktor, der sowohl für die Somitogenese als auch für die Ausbildung der LR-Körperachse benötigt wird. Ein Zusammenhang zwischen diesen Prozessen ist ein lang bekanntes Phänomen, dessen Ursache bisher nicht geklärt wurde. Aufgrund der Integration der sLRO Zellen in das paraxiale presomitische Mesoderm, dem Vorläufergewebe der Somiten, stellte sich die Frage, ob dies eine Verbindung zwischen diesen zwei Prozessen erklären könnte. Die Untersuchung von Xenopus Embryonen nach Manipulation von dmrt2 zeigte, dass die Spezifizierung des paraxialen Mesoderms in der frühen Gastrula für die Ausbildung der sLRO Zellen ausschlaggebend ist. Über die Induktion des myogenen Transkriptionsfaktors myf5 reguliert Dmrt2 die Spezifizierung des paraxialen Mesoderms und ins Besondere der sLRO Zellen in Xenopus. Dies demonstrierte zum ersten Mal experimentell eine direkte Verbindung zwischen der frühen Somitogenese und der Lateralitätsdeterminierung und liefert eine erste Erklärung wie diese Prozesse zusammenhängen.