Hyperthermie steigert die Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin durch Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung und der damit einhergehenden Verhinderung der Replikationsblockade

Abstract

Peritoneal carcinomatosis describes widespread metastases of cancerous tumors in the peritoneal cavity particularly arising from ovarian and colon cancers. For long time this far advanced tumor disease was considered extremely difficult to treat. Therefore, only palliative measures were carried out in most cases. This has changed significantly in recent years with the introduction of multimodal treatment options consisting of a complete macroscopic tumor reduction (CRS) followed by an intraoperative intraperitoneal hyperthermic chemotherapy (HIPEC). It is undisputed that this local chemotherapy application allows treatment with much higher drug concentrations as compared to the systemic therapy. However, the role of hyperthermia in this multimodal approach has not been fully clarified so far. There is still no clinical study available showing a clear benefit of elevated temperature in the intraperitoneal chemotherapy. Largely unknown is also which level of temperatures are really needed for an elevated cytotoxicity of chemotherapeutics. Furthermore, the molecular mechanisms behind this synergistic effect are poorly investigated. To answer these questions, an in vitro model was established mimicking the situation of the HIPEC procedure as closely as possible. This model allowed to define a very precise temperature threshold of 40°C. An effective increase in cytotoxicity of cisplatin and doxorubicin was only observed at temperatures of 40°C or above. Importantly, this temperature threshold was also of clinical relevance. Patients who reached this temperature over at least 40 minutes at two sites in the abdominal cavity, namely omental bursa and pelvis, showed a significantly increased overall and progression free survival. In-vitro hyperthermia leads to an increased intracellular concentration of doxorubicin. Interestingly, however, the synergy of hyperthermia with doxorubicin was observed even after reducing the drug concentrations to values which are also reached at 37° C. Together with the finding that hyperthermia had no effect on the amount of DNA-cisplatin adducts, these results clearly indicate that the increased intracellular drug accumulation is not the predominant mechanism behind the synergistic effects of chemotherapeutics and hyperthermia. Rather a compromised repair of cisplatin and doxorubicin induced DNA damages upon hyperthermia treatment could be identified to be important for the observed effects. This significantly delayed DNA repair depends on inhibition of the poly(ADR-ribosyl)ation (PARylation) by hyperthermia. Interestingly, hyperthermia selectively increased the efficiency of cytotoxic agents that induce PARylation. The hypothesis that inhibition of PARylation plays a key role for the synergy between hyperthermia and chemotherapy is further supported by the finding that the treatment with specific pharmacological PARP inhibitors resulted in a comparable elevation of cisplatin and doxorubicin induced cytotoxicity. In this respect PARylation could be identified as a molecular marker for a preclinical substance-screen to identify drugs acting together with hyperthermia. In addition, these in-vitro results for the first time show that there are alternatives to the hyperthermic treatment, which is associated with considerable side effects. Thus, intraperitoneal chemotherapy could be combined with systemic PARP inhibitor pre-treatment. Clinically approved specific PARP inhibitors are far better tolerated by patients than hyperthermia. Hyperthermia mediated inhibition of PARylation led to an increase in the percentage of cells with DNA double-strand breaks (DSB). Interestingly, the results of this work indicate a hyperthermia-induced switch from HR to the error-prone NHEJ. In combination with hyperthermia there was a significant increase in P-53BP1 foci formation, while both the percentage of cells with Rad51 foci and Rad51 protein level remained unchanged. The finding that these DSBs occur only in S-phase cells points to a replication-associated mechanism. In fact, in the framework of this work it could be demonstrated for the first time that drug-induced stalled replication forks are circumvented by the hyperthermia-mediated inhibition of PARylation. The unhindered progression of replication forks upon inhibition of PARylation by hyperthermia or pharmacological PARP inhibition presumably results in the increase of DNA DSBs as well as in the significantly reduced long-term-survival

Bei der Peritonealkarzinose handelt es sich um eine Metastasierung des Bauchfells (Peritoneum), die insbesondere von Ovarial- und Kolonkarzinomen im Laufe der Tumorprogression ausgeht. Lange Zeit galt diese weit fortgeschrittene Tumorerkrankung als extrem schwer therapierbar, sodass in der Regel nur palliativmedizinische Maßnahmen durchgeführt wurden. Dies hat sich in den letzten Jahren durch die Einführung multimodaler Behandlungsoptionen maßgeblich gewan-delt. Diese bestehen aus einer kompletten makroskopischen Tumorreduktion (CRS) gefolgt von einer intraoperativen, intraperitonealen hyperthermen Chemotherapie (HIPEC). Unbestritten ist, dass durch die lokal begrenzte Applikation wesentlich höhere Konzentrationen der Chemothera-peutika im Vergleich zur systemischen-Therapie verabreicht werden können. Der Stellenwert der Hyperthermie in diesem multimodalen Konzept ist bislang allerdings nicht eindeutig geklärt. So existieren bis heute keine klinischen Studien, die einen Benefit der erhöhten Temperatur bei der intraperitonealen Chemotherapie (IP-Chemotherapie) eindeutig belegen. Weitgehend ungeklärt ist auch, welche Temperaturen für eine Zytotoxizitätssteigerung der Chemotherapie wirklich notwendig sind und welche molekularen Mechanismen einer solchen Effizienzsteigerung zugrunde liegen. Um diese Fragen beantworten zu können wurde in vorliegender Arbeit zunächst ein in vitro-Modell etabliert, das die Situation der HIPEC-Prozedur möglichst exakt wiederspiegelt. Mit Hilfe dieses Modells gelang es, einen sehr präzisen Temperaturschwellenwert zu identifizieren, ab welchem eine effiziente Steigerung der Zytotoxizität von Cisplatin und Doxorubicin erzielt werden kann. Dieser Temperaturschwellenwert von 40°C ist auch von klinischer Relevanz. So weisen Patienten, die diese Temperatur an zwei Stellen im Bauchraum, nämlich Bursa omentalis und Pelvis, über mindestens 40 Minuten erreichten, ein signifikant erhöhtes Gesamt- und progressionsfreies Überleben auf. In-vitro führt Hyperthermie zu einer gesteigerten intrazellulären Doxorubicin-Konzentration. Interessanterweise bleibt allerdings die Synergie von Hyperthermie mit Doxorubicin selbst dann erhalten, wenn die Doxorubicindosierung auf Werte reduziert wird, die auch bei 37°C erreicht werden. Zusammen mit dem Befund, dass Hyperthemie keinen Einfluss auf die Menge der DNA-Cisplatin-Addukte hat, weisen diese Ergebnisse sehr klar darauf hin, dass die erhöhte Zytostatika-Aufnahme nicht der prädominante Mechanismus hinter den Synergieeffekten von Zytostatika und Hyperthermie ist. Vielmehr konnte eine durch Hyperthermie kompromittierte DNA-Reparatur-kapazität sowohl nach Doxorubicin als auch nach Cisplatin gezeigt werden. Die signifikante Verzögerung der DNA-Reparatur konnte auf eine Hyperthermie bedingte Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung (PARylierung) zurückgeführt werden. Interessanterweise kann durch Hyperthermie ausschließlich die Effizienz solcher Zytostatika gesteigert werden, die eine PARylierung induzieren. Die These, dass die Hemmung der PARylierung eine zentrale Rolle für die Synergie zwischen Hyperthermie und Chemotherapie darstellt, wird darüber hinaus durch den Befund gestützt, dass spezifische pharmakologische PARP-Inhibitoren zu vergleichbaren Zytotoxizitätssteigerungen von Cisplatin und Doxorubicin führen wie sie durch Hyperthermie erreicht werden. Insofern konnte die PARylierung als molekularer Marker für einen präklinischen Substanzscreen für HIPEC-Zytostatika identifiziert werden. Darüber hinaus zeigen diese in-vitro-Ergebnisse erstmals, dass es durchaus Alternativen zu der mit erheblichen Nebenwirkungen behafteten Hyperthermie-Behandlung gibt. So könnte eine intraperitoneale Chemotherapie mit einer systemischen Vorbehandlung der Patienten mit den sehr verträglicheren PARP-Inhibitoren kombiniert werden. Die Hyperthermie-vermittelte Hemmung der PARylierung führt zu vermehrten DNA-Doppel-strangbrüchen (DSB), welche tendenziell im Vergleich zur normothermen Behandlung eher über das fehlerbehaftete NHEJ repariert werden. So kommt es durch die Kombination mit Hyperthermie in signifikant mehr Zellen zu einer P-53BP1-Foci-Formierung, während sowohl der prozentuale Anteil der Zellen mit RAD51-Foci als auch die Gesamt-RAD51-Proteinmenge unverändert bleibt. Der Befund, dass diese DSB ausschließlich in S-Phasen-Zellen auftreten, wies auf einen Replikations-assoziierten Mechanismus hin. Tatsächlich konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals gezeigt werden,dass die Zytostatika-induzierten Replikationsblockaden durch die Hyperthermie-vermittelte Hemmung der PARylierung aufgehoben werden. Das Resultat dieser ungehinderten Progression der Replikationsgabeln durch die Hemmung der PARylierung nach Hyperthermie oder pharmakologischer PARP-Inhibition ist dann vermutlich die beobachtete Zunahme der DNA-DSB sowie das signifikant reduzierte Langzeitüberleben.