Oszillation und Musterbildung in reinen und Polypeptid-dotierten Bilayern

Abstract

The question of how lipids and proteins interact in bilayers and membranes and why cells and organelles have different lipid compositions in their membranes has been in focus of research for decades. Which role these different lipid compositions play for interaction between integrated and associated proteins has not yet been clarified until today. This thesis with the title "Oszillation und Musterbildung in reinen und Polypeptid-dotierten Bilayern" focuses on forces that influence the interaction of lipids and proteins. In both, living cells as well as in bilayer experiments, the protein-lipid interaction is a complex process involving a huge number of molecules. Different test series with temperature and amperage have been carried out using electrophysiological experiments with bilayers and fluorescence in vesicles. The results were used to determine similarities and differences that indicate certain characteristics of the setup and the interaction among the molecules. Since the question of the interaction between proteins and lipids is a very complex process, the already well-known pore former alamethicin has been used for this work. Alamethicin was used in the both types of experiments, bilayer and vesicles, with different lipid compositions consisting of DOPC, DOPE, DOPS and DMPC. The lipids were solved in ethanol first and then added with certain concentrations of alamethicin in two test chambers which were connected to each other by a small hole. In this hole the bilayer was formed by the addition of aqueous KCl solution. After that the current-clamp-method with different currents was used and subjected to the bilayer. The resulting voltage profiles were observed for oscillation patterns. Subsequently, the obtained data were subjected to the method of Fourier-Transformation to separate the results from noise and interference as well as overlays which resulted from the multi-channel system of alamethicin. The Fourier-Transformation has shown a large number of heterogeneous oscillation patterns. Due to the great heterogeneity of the results that did not allow direct comparisons of individual data with each other the average time-period of oscillation was calculated. This data were used to form data clouds where regression lines were generated. In addition the slopes of the lines were calculated for comparison. The results show that the orientation and slope angle of the slopes directly dependent on the concentrations of alamethicin and KCl. It was found that the addition of a small amount of negatively charged lipid like DOPS to a mixture of DOPC and DOPE has a big impact on the results and can change the orientation of the slopes of the average time-period of oscillation. Similar results were found while using asolectin bilayer containing inositol that is negatively charged, too. As a result, it was concluded that contrary to previous assumptions of some earlier work groups, bilayers are not pure hydrophobic barrier layers between two aqueous phases but highly complex structures that affect the gating of its integrated pores in different ways. The insert and operation of alamethicin strongly depends on the used lipids. Moreover a major dependency from the used salt concentration of the alamethicin pores and bilayer stability was found. The experiments with DMPC and temperature showed that the chain length of the lipids play an important role for integrated proteins on the one hand. On the other hand it could be confirmed that the phase transition of lipids can comprise a wide range of temperature of several degree Celsius depending on the experimental conditions. It could also be confirmed that alamethicin remains active in the liquid-crystal domains during phase transition of a bilayer. In addition it was found that temperature dependent changes appear in voltage oscillation patterns that affect both the average time-period and its resulting slopes in angle and orientation.

Die vorliegende Arbeit mit dem Titel "Oszillation und Musterbildung in reinen und Polypeptid-dotierten Bilayern" beschäftigt sich mit der Frage, weshalb Zellen und Organellen unterschiedliche Lipidzusammensetzungen in ihren Membranen besitzen und welche Rolle diese für die Funktionsweise von integrierten und assoziierten Proteinen spielen. Diese Fragen stehen seit Jahrzehnten im Fokus der Forschung, konnten jedoch noch nicht eindeutig geklärt werden. In dieser Arbeit steht die Frage im Fokus, welche Kräfte und Faktoren die Interaktion von Lipiden und Proteinen beeinflussen und damit für die Interaktion förderlich oder hinderlich sind. Da die Protein-Lipid-Interaktion sowohl in lebenden Zellen als auch im Bilayer-Experiment einen komplexen Vorgang darstellt, an dem unzählige Moleküle beteiligt sind, konnten die gewünschten Ergebnisse nicht durch direkte Beobachtung einzelner Moleküle gewonnen werden. Zu diesem Zweck sind unterschiedliche Reihen von elektrophysiologischen Versuchen mit Bilayern sowie Fluoreszenzversuche mit Vesikeln durchgeführt worden. Die Ergebnisse wurden anschließend miteinander verglichen, um Ähnlichkeiten und Abweichungen festzustellen, die auf bestimmte Charakteristika der Moleküle im Zusammenspiel mit anderen Molekülen und Kräften wie Temperatur und Stromstärke hindeuten. Da sich die Fragestellung um die Interaktion zwischen Proteinen und Lipiden als sehr komplex darstellt, wurde der bereits gut erforschte Porenbildner Alamethicin als Modellsystem in reinen Lipidbilayern verwendet. Dieser wurde in den Bilayer- und Vesikel-Experimenten zusammen mit unterschiedlichen Lipidkompositionen, bestehend aus DOPC, DOPE, DOPS und DMPC, eingesetzt. Die Lipide wurden zunächst in Ethanol gelöst und anschließend mit bestimmten Konzentrationen von Alamethicin in zwei nebeneinander liegende Versuchskammern gegeben, die durch eine Bohrung miteinander verbunden waren. In der Bohrung sollten die Lipide anschließend nach der Zugabe von wässriger KCl-Lösung Bilayer bilden. Daraufhin wurden die Bilayer unterschiedlichen elektrophysiologischen Messungen mit unterschiedlichen Stromstärken der Stromklemme unterzogen. Die daraus resultierenden Spannungsverläufe, die aus dem Öffnen und Schließen der Poren durch Alamethicin induziert worden sind, wurden gemessen. Dabei konnten qualitativ und quantitativ unterschiedliche Oszillationen mit unterschiedlichen Periodendauern festgestellt werden, die von den verwendeten Versuchsparametern abhängig waren. Anschließend wurden die gewonnenen Daten der Fourier-Transformation unterzogen, um die Ergebnisse vom Grundrauschen und von Störungen, aber auch Überlagerungen, die aus dem Vielkanalsystem des Alamethicins resultierten, zu trennen. Hierbei konnte eine Vielzahl sehr heterogener Oszillationen mit teils ähnlichen und unterschiedlichen Periodendauern festgestellt werden. Aufgrund der großen Heterogenität der Ergebnisse, die keine direkten Vergleiche der Einzelergebnisse miteinander zuließ, wurden verschiedene durchschnittliche Periodendauern der Oszillationen berechnet. Bei diesen konnte eine Abhängigkeit der Periodendauer der Oszillationen von der verwendeten Alamethicinkonzentration und KCl-Konzentration festgestellt werden, indem die Steigungen der daraus resultierenden Datensätze ermittelt und mit anderen Steigungen anderer Versuche verglichen wurden. Es konnte festgestellt werden, dass die geringe Zugabe eines negativ geladenen Lipids wie DOPS zu einem Lipidgemisch aus DOPC und DOPE zu deutlich veränderten Ergebnissen führen kann. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Verwendung von Asolectin-Bilayern erzielt. Hier kann der beobachtete Effekt auf die negative Ladung der integrierten Inositole zurückgeführt werden. Daraus resultierend wurde darauf geschlossen, dass im Gegensatz zu bisherigen Annahmen einiger früherer Arbeitsgruppen, Bilayer keine puren hydrophoben Trennschichten zwischen zwei wässrigen Phasen, sondern hochkomplexe Strukturen darstellen. Der Einbau und die Wirkungsweise des Alamethicins hängen stark von den verwendeten Lipiden des Bilayers ab, in den es integriert werden soll. Darüber hinaus konnte eine große Abhängigkeit der durch Alamethicin induzierten Poren und des Bilayers von den verwendeten Salzkonzentrationen in den wässrigen Lösungen festgestellt werden. Die Temperaturversuche mit DMPC und Alamethicin zeigten einerseits, dass die Kohlenwasserstoff-Kettenlänge der Lipide im Bilayer eine wichtige Rolle für integrierte Proteine spielt. Andererseits konnte bestätigt werden, dass der Phasenübergang eines Lipids einen breiten Temperaturbereich umfassen kann. Hier konnte festgestellt werden, dass Alamethicin im Phasenübergang in den flüssig-kristallinen Domänen des Bilayers aktiv bleibt, wobei temperaturabhängige Veränderungen der Spannungsoszillationen und der daraus resultierenden durchschnittlichen Periodendauern zu beobachten sind.