Charakterisierung primärer Tumor-assoziierter Fibroblasten und Tumorzellen aus bronchialen Karzinomen und Untersuchung ihrer Reaktion auf zielgerichtete und zytotoxische Therapie

Abstract

Worldwide lung cancer is the leading cause of death among all malignancies. This is largely due to its high frequency of diagnosis and its poor 5-year survival rate of 15%. As a solid tumor, lung cancer consists of tumor cells and a variable stromal part, that is made up of a cellular and a non-cellular fraction. The stroma influences several processes like growth, invasion of surrounding tissues, metastatic spread as well as tumor supply of oxygen and nutrients. Thereby, the stroma is dominated by the cancer-associated fibroblasts (CAFs), actively shaping the microenvironment through the secretion of soluble factors and the synthesis of extracellular matrix (ECM) components. While there are several studies with the aim of identifying the differences between CAFs and normal fibroblasts (NAFs) of the breast, there is only little information about those differences in the corresponding cells of the lung. One of the aims of the study was the identification of the molecular differences between CAFs and NAFs derived from lung tissue. A further objective was the investigation of therapy effects under conditions that mimic the situation in vivo. Therefore, an ex vivo-model allowing the culture of primary lung tumor tissue had to be evaluated. Afterwards, the effect of the epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor Erlotinib on tumor cell proliferation was investigated in this model system. To investigate a response of both, tumor cells and their adjacent CAFs to chemotherapy, lung cancer tissue samples were treated with cisplatin. Finally, owing to their important role in tumors, CAFs were chosen as a target for therapy using small molecule inhibitors, with the aim of inhibiting their stimulatory effect. Molecular comparison of isolated CAFs and the corresponding NAFs of 9 lung cancer patients revealed a significantly different expression of 60 genes. The identification of a set of differentially regulated genes is quite surprising because of the assumable activation of NAFs due to culture conditions. This indicates that CAFs are more than just activated fibroblasts, which are found at sites of tissue injury. Rather, they are a distinct cell type showing parallels to activated fibroblasts. Expression data for 46 of the 60 identified genes were available in a Non-Small Cell Lung Cancer collective comprising of 342 patients. As it turned out, a NAF-like expression of the genes was associated with a significantly better survival prognosis. Another central objective of the work was the investigation of the tumor cell response to therapy in an intact tissue. An already established tissue culture system required initial validation. This was done by comparing the tissue which has been cultivated for 4 days with the corresponding tissue, that has been fixed immediately after surgery. No significant changes in morphology and biological function were detected. Thus the model system adequately mimics the situation in the patient and a negative effect of the culture could be excluded. This makes the system an excellent opportunity to investigate the effect of a drug under in vivo-like conditions. Treatment of tissue samples, characterized for EGFR expression, and EGFR, and KRAS gene status, with the small-molecule inhibitor Erlotinib displayed no effect on the proliferation of the analysed tumor cells.This reflects the situation in the clinics quite adequately where only a small proportion of patients benefits from the treatment with the EGFR-inhibitor Erlotinib. To follow-up, the reaction of CAFs and tumor cells on a chemotherapeutical treatment was investigated under in vivo-like conditions. Interestingly, cisplatin led to a parallel accumulation of p53 and induction of cell death in tumor cells and their adjacent CAFs. Thereby, the p53 accumulation of CAFs seems to be dictated by their tumor cells because the same CAFs which do not accumulate p53 in the tissue, respond to cisplatin with the accumulation of p53 in the isolated state. Therefore, it is tempting to speculate that tumor cells modulate the DNA damage response of their microenvironment, with the objective to raise their own chemoresistance. Inhibiting CAF proliferation was examined as a feasible approach to inhibit their tumor-stimulating properties. Screening of a kinase inhibitor library consisting of 160 small molecule inhibitors resulted in the identification of PDGFR signaling as a promising target. Among the FDA approved PDGFR inhibitors Dasatinib turned out to be the most potent inhibitor of CAF proliferation, resulting in a molecular phenotype comparable to that of normal fibroblasts. Furthermore, the Dasatinib-mediated changes in CAFs led to the secretion of factors, inhibiting the proliferation of lung tumor cells. In contrast, the secreted factors of untreated CAFs stimulated their proliferation. Together, these results indicate that Dasatinib treatment is a promising approach to reduce the tumor promoting capacity of CAFs.

Das Bronchialkarzinom ist diejenige Krebserkrankung, die weltweit die meisten Todesopfer fordert, was zum einen an seiner relativ hohen Häufigkeit liegt, zum anderen an der geringen Überlebensrate, die nach 5 Jahren bei lediglich 15% liegt. Als solider Tumor besteht es aus einem Tumorzellanteil und einem variablen Stromaanteil, welcher sowohl aus zellulären als auch aus nicht-zellulären Anteilen besteht. Das Tumorstroma beeinflusst dabei zahlreiche Prozesse, zu denen das Wachstum des Tumors, die Invasion umliegender Gewebe, die Metastasierung sowie die Versorgung durch Gefäße gehören. Dominiert wird der zelluläre Anteil des Stromas von den ?Cancer-Associated Fibroblasts?, den CAFs, die durch die Sekretion solubler Faktoren und die Synthese von Komponenten der extrazellulären Matrix, die Mikroumgebung des Tumors gestalten. Während die Unterschiede zwischen CAFs und normalen Fibroblasten (NAFs) der Brust im Fokus zahlreicher Studien standen, ist wenig über diese Unterschiede bei den entsprechenden Zellen der Lunge bekannt. Ziel der Arbeit war, die molekularen Unterschiede zwischen CAFs und NAFs der Lunge zu identifizieren. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war es, die Folgen einer Therapie unter möglichst in vivo-nahen Bedingungen zu untersuchen. Hierfür wurde ein ex vivo-Modell validiert, welches die Kultur primären Gewebes ermöglicht. Dabei sollte der Einfluss des EGFR-Inhibitors Erlotinib auf die Proliferation von Tumorzellen untersucht werden. Durch eine chemotherapeutische Behandlung des Gewebes, welche sich sowohl auf Tumorzellen als auch auf Zellen des Stromas auswirkt, wurde darüber hinaus überprüft, ob es im Gewebe zu einer koordinierten Antwort dieser Zelltypen kommt. Aufgrund der wichtigen Rolle der CAFs in Tumoren wurde schließlich nach Möglichkeiten gesucht, CAFs in ihrer Aktivität durch niedermolekulare Inhibitoren zu hemmen. Der Vergleich von isolierten CAFs und NAFs aus 9 Patienten mit primärem Bronchialkarzinom ergab, dass 60 Gene signifikant differenziell exprimiert werden. Da anzunehmen ist, dass es durch die Kulturbedingung zu einer Aktivierung der NAFs kommt, ist es erstaunlich, dass dennoch Unterschiede zwischen CAFs und NAFs festgestellt wurden. Dies deutet darauf hin, dass es sich bei CAFs nicht nur um aktivierte Fibroblasten handelt, wie sie in Wunden vorzufinden sind, sondern um einen Zelltyp, der lediglich Parallelen zu aktivierten Fibroblasten aufweist. Zu 46 der 60 so identifizierten Gene lagen Expressionsdaten in einem 342 Patienten umfassenden NSCLC-Kollektiv vor. Wie sich bei einer Überlebensanalyse zeigte, haben Patienten, welche eine NAF-ähnliche Expression der Gene in ihren Tumoren aufweisen, eine signifikant bessere Prognose als die übrigen Patienten des Kollektivs. Ein zentrales Thema der vorliegenden Arbeit war es, die Reaktion von Zellen des Tumors auf Antitumor-Medikamente im intakten Gewebe zu untersuchen. Dafür wurde das im Haus etablierte Modell der Gewebekultur verwendet, das zunächst validiert wurde. Dazu wurde Gewebe, welches direkt nach der Operation fixiert wurde mit Gewebe desselben Patienten, das für 4 Tage kultiviert wurde, verglichen. Es konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Morphologie und der biologischen Funktion festgestellt werden. Somit konnte ausgeschlossen werden, dass die Kultur das Gewebe negativ beeinflußt und man konnte davon ausgehen, dass die Situation in vivo in hohem Maße widergespiegelt wird. Daher stellt das System eine hervorragende Möglichkeit dar, die Folgen einer Therapie unter in vivo-nahen Bedingungen zu untersuchen. Bei der Erlotinib-Behandlung der kultivierten Karzinome, die zunächst hinsichtlich ihrer EGFR-Expression bzw. ihres EGFR- und KRAS-Status charakterisiert wurden, zeigte sich keine Abnahme des Anteils proliferierender Tumorzellen durch den niedermolekularen EGFR-Inhibitor. Diese in der Gewebekultur gemachte Beobachtung spiegelt die Situation in der Klinik wieder, wo nur ein geringer Anteil der NSCLC-Patienten auf eine Erlotinibtherapie reagiert. Anschließend wurde die Reaktion von CAFs und Tumorzellen auf eine chemotherapeutische Behandlung unter in vivo-nahen Bedingungen im Gewebekulturmodell untersucht. Interessanterweise zeigten sich infolge der Behandlung mit Cisplatin zwischen den Tumorzellen und CAFs desselben Tumors deutliche Parallelen hinsichtlich der p53-Akkumulation und der Zelltodinduktion. Die p53-Akkumulation der CAFs scheint durch die Kommunikation mit den benachbarten Tumorzellen bestimmt zu werden, da CAFs von Tumoren, welche im Gewebe kein p53 akkumulieren, im isolierten Zustand eine Cisplatin-abhängige Akkumulation aufweisen. Dies deutet darauf hin, dass Tumorzellen die Reaktion ihrer Mikroumgebung auf Schäden in der DNA kontrollieren, um sich vor den Folgen einer Therapie zu schützen. Um die stimulierenden Eigenschaften der CAFs zu beeinflussen, wurde nach Möglichkeiten gesucht ihre Proliferation zu hemmen. Durch das Screening einer Substanzbibliothek bestehend aus 160 niedermolekularen Kinase-Inhibitoren wurde die Hemmungn des PDGFR-Signalweges als vielversprechender Ansatz identifiziert. Unter den zugelassenen PDGFR-Inhibitoren war Dasatinib der potenteste und Transkriptomanalysen zeigten, dass Dasatinib in CAFs zu einem NAF-ähnlichen Expressionsmuster führt. Die Dasatinib-vermittelten Veränderungen im Phänotyp der CAFs führten dazu, dass die CAFs soluble Faktoren sekretieren, welche die Proliferation der Lungenkarzinomlinie H1299 hemmen. Unbehandelte CAFs sekretieren hingegen Faktoren, welche die Proliferation stimulieren, wie Versuche mit konditioniertem Medium zeigten. Dasatinib scheint somit eine vielversprechende Möglichkeit darzustellen, den stimulierenden Einfluss des Stromas auf die Tumorprogression zu hemmen.