Membrane targeting and insertion of the sensor protein KdpD and the C-tail anchored protein SciP of Escherichia coli

Abstract

In E. coli, most inner membrane proteins are targeted in a co-translational manner by the universally conserved signal recognition particle (Bernstein et al. 1989; Valent et al. 1998; Schibich et al. 2016). SRP scans the translating ribosomes and binds with high affinity to an exposed SRP signal sequence, present in the nascent chain (Bornemann et al. 2008; Holtkamp et al. 2012; Saraogi et al. 2014). After targeting to the membrane-associated SRP receptor FtsY, the nascent membrane protein is forwarded to the Sec translocase or to the YidC insertase to be integrated into the bilayer (Miller et al. 1994; Cross et al. 2009; Welte et al. 2012; Akopian et al. 2013). In general, the targeting and insertion pathways of inner membrane proteins in E. coli are already well studied. However, there is a special class of proteins, the C-tail anchored proteins with only a few members in E. coli, whose insertion mechanisms are unknown in prokaryotes to date. To study those insertion mechanisms, the C-tail anchored protein SciP was used as a model protein. SciP from the enteroaggregative E. coli is a structural component of the type 6 secretion system and contains a transmembrane domain (TMD) at the extreme C-terminal part from amino acid 184 to 206. This results in a large N-terminal cytoplasmic domain of 183 amino acids. In E. coli, there is another protein, the potassium sensor protein KdpD which shares with SciP the commonality of a large N-terminal cytoplasmic domain. KdpD is a four-spanning membrane protein with the first TMD starting at amino acid position 400. For both proteins, with the TMD being located far away from the cytoplasmic N-terminal part, it was thought that they cannot use the co-translational SRP pathway. However, it was shown that KdpD is targeted co-translationally by SRP and a cytoplasmic targeting signal located between amino acids 22-48 was identified (Maier et al. 2008). In this study it was shown that the C-tail anchored protein SciP is also targeted early during translation by SRP. With fluorescence microscopy studies and sfGFP-SciP fusion constructs, two short hydrophobic regions in the N-terminal cytoplasmic domain (amino acids 12-20 and 62-71) were identified as being important for membrane targeting. With artificially stalled ribosomes exposing each of the targeting signal, microscale thermophoresis meausurements decoded that both signals bind to SRP and to a preincubated SRP-FtsY complex, mimicking the next targeting step. Cysteine-accessibilty assays demonstrated that SciP is the first described protein with two targeting signals since the deletion of one of the hydrophobic regions was compensated by the other remaining one in vivo. To decipher the crucial features of the novel cytoplasmic SRP signal sequences of KdpD and SciP alterations in the signal sequences were analyzed with fluorescence microscopy using sfGFP fusion constructs and microscale thermophoresis measurements using stalled ribosomes. These studies revealed that the novel signal sequences have to exceed a threshold level of hydrophobicity to be recognized and bound by SRP and target sfGFP to the membrane. In addition, three positively charged amino acids in the KdpD SRP signal sequence were identified to promote SRP binding. To characterize the binding mechanism of SRP to the signal sequences, in vitro disulphide cross-linking studies with synthesized KdpD22-48, SciP1-27 and SciP54-85 peptides were performed. All three peptides could be cross-linked to the hydrophobic groove of SRP formed by the M domain, which correlates with the binding of SRP to other substrates. Taken together, the results show that SRP binding is not limited to the TMDs of proteins. SRP is also able to recognize short hydrophobic stretches in the cytoplasmic domain of inner membrane proteins. Cysteine-accessibility assays with the C-tail anchored protein SciP decoded that not only SRP is involved in the delivery pathway but also the insertase YidC. With only 11 amino acids in the periplasmic domain SciP matches with the characteristics of other known YidC only substrates. By extending the C-tail of SciP it was found out that a critical length of 20 amino acids exists and that the exceed of this limit makes the insertion of SciP dependent on the Sec translocase. The studies with the extended C-tails of SciP helped to gain more general information about the YidC dependent insertion of proteins. The results obtained with the protein SciP are first indications about how the insertion of C-tail anchored proteins occurs in E. coli. It is assumed that the SRP system and the insertase YidC compensate the absence of the eukaryotic Get system, responsible for the insertion of eukaryotic tail-anchored proteins.

In E. coli werden die meisten integralen Proteine co-translational durch das universell konservierte SRP an die Membran geleitet (Bernstein et al. 1989; Valent et al. 1998; Schibich et al. 2016). SRP scannt translatierende Ribosomen und bindet mit hoher Affinität an eine exponierte SRP Signalsequenz der naszierenden Proteinkette (Bornemann et al. 2008; Holtkamp et al. 2012; Saraogi et al. 2014). Nach dem Transport zum Membran-assoziierten SRP Rezeptor FtsY wird das naszierende Membranprotein an die Sec Translokase oder YidC zur Insertion in den Bilayer übergeben (Miller et al. 1994; Cross et al. 2009; Welte et al. 2012; Akopian et al. 2013). Allgemein sind die Transport- und Insertionswege von Membranproteinen in E. coli bereits sehr gut untersucht. Zu einer speziellen Proteinklasse, mit nur wenigen Proteinen in E. coli, gehören die sogenannten „C-tail anchored“ Proteine, deren Insertionsweg in Prokaryoten bislang jedoch unbekannt ist. Um den Insertionsweg zu erforschen, wurde das „C-tail anchored“ Protein SciP als Modellprotein ausgewählt. SciP aus dem enteroaggregativen E. coli stellt eine strukturelle Komponente des Typ 6 Sekretionssystems dar und besitzt eine Transmembrandomäne (TMD) am C-Terminus von Aminosäure (AS) 184 bis 206. Somit weist SciP eine große N-terminale cytoplasmatische Domäne von 183 AS auf. Ein weiteres E. coli Protein, das Sensorprotein KdpD, teilt mit SciP die Gemeinsamkeit einer großen N-terminalen cytoplasmatischen Domäne. KdpD ist ein vier-spänniges Membranprotein, bei dem die erste TMD nach 400 AS beginnt. Zunächst wurde angenommen, dass die spezielle Topologie dieser beiden Proteine einen co-translationalen SRP-abhängigen Transport ausschließt. Dennoch konnte gezeigt werden, dass KdpD durch ein cytoplasmatisches Transportsignal zwischen den AS 22 und 48 durch SRP erkannt und co-translational an die Membran gebracht wird (Maier et al. 2008). In dieser Studie wurde gezeigt, dass ebenfalls das „C-tail anchored“ Protein SciP bereits zu Beginn der Translation durch SRP an die Membran geleitet wird. Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie und sfGFP-SciP Fusionskonstrukten wurden zwei kurze hydrophobe Bereiche in der N-terminalen cytoplasmatischen Domäne (AS 12-20 und 62-71) identifiziert, die wichtig für den Transport sind. Mit translations-pausierten Ribosomen, die jeweils eines der beiden Transportsignale von SciP exponieren, konnte durch Microscale Thermophorese entschlüsselt werden, dass beide Transportsignale während der Translation von SRP und einem SRP-FtsY Komplex gebunden werden. Über Cystein-Modifikationsstudien wurde bestätigt, dass SciP das erste beschriebene Protein mit zwei SRP-Signalen darstellt, da die Deletion eines der beiden Signale durch die Anwesenheit des jeweils anderen in vivo ausgeglichen werden kann. Um die ausschlaggebenden Merkmale der neuartigen cytoplasmatischen SRP-Signalsequenzen von KdpD und SciP zu identifizieren, wurden die Signalsequenzen modifiziert. Die Auswirkungen wurden mit Hilfe von sfGFP-Fusionskonstrukten und der Fluoreszenzmikroskopie sowie mit der Microscale Thermophorese und künstlich pausierten Ribosomen analysiert. Damit wurde gezeigt, dass auch die neuartigen Signalsequenzen ein kritisches Hydrophobizitätslevel überschreiten müssen, um von SRP erkannt und gebunden zu werden und daraufhin zum Transport von sfGFP an die Membran führen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass drei positiv geladene AS in der SRP Signalsequenz von KdpD die SRP Bindung verstärken. Um den Bindemechanismus von SRP an die Signalsequenzen zu charakterisieren, wurden in vitro Disulfid-Crosslinking-Studien mit synthetisierten KdpD22-48, SciP1-27 und SciP54-85 Peptiden durchgeführt. Alle drei Peptide konnten an die hydrophobe Bindetasche der M-Domäne von SRP gebunden werden, was mit der Bindung anderer SRP Substrate übereinstimmt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die SRP Bindung nicht auf eine TMD eines Proteins beschränkt ist, sondern dass auch kurze hydrophobe Bereiche in cytoplasmatischen Domänen als SRP Signale agieren können. Cystein-Modifikationsstudien mit dem Protein SciP zeigten, dass nicht nur SRP sondern auch YidC am Insertionsprozess beteiligt ist. Mit nur 11 AS in der periplasmatischen Domäne stimmt diese Charakteristik mit anderen YidC Substraten überein. Durch die Verlängerung der periplasmatischen Domäne von SciP zeigte sich, dass es eine kritische Länge von 20 AS gibt und dass die Überschreitung die Insertion Sec-abhängig werden lässt. Anhand der Studien mit den verlängerten periplasmatischen Domänen von SciP konnten allgemeine Informationen über den YidC Insertionsprozess erlangt werden. Die Ergebnisse mit SciP sind die ersten Anhaltspunkte, wie die Insertion der speziellen „C-tail anchored“ Proteine in E. coli stattfinden könnte. Es wird angenommen, dass das SRP System und die YidC Insertase das Fehlen des eukaryotischen Get-Systems, welches eukaryotische „tail-anchored“ Proteine inseriert, ersetzen kann.