Molecular evidence of intraclonal variation and implications for adaptational traits of grape phylloxera populations (Daktulosphaira vitifoliae, Fitch)

Abstract

Grape phylloxera (Daktulosphaira vitifoliae Fitch; Homoptera: Phylloxeridae) is an economical important insect pest of grapevine (Vitis spp.) worldwide. The insect was introduced with contaminated plant material from North America in the 1850s and spread rapidly across all European viticultural regions. In the 19th century, nearly three-forths of the ungrafted and highly susceptible European grape species were destroyed by the insect pest. European viticulture did not recover until the development of grafting, combining European Vitis vinifera varieties with resistant rootstocks, bred from American Vitis species. Grape phylloxera is still present in viticulture. Today, grape phylloxera populations mainly persist in abandoned vineyards and rootstock nurseries. Grape phylloxera populations seem to be variable in terms of genotypic composition and host adaptability. The lifecycle described by Fitch (1854) and others in the 19th century does not seem to match actual conditions anymore. This thesis aimed at redefining the genetic structure of European grape phylloxera populations by employing genetic markers. It was shown, that the insect has turned away from its classical holocycle and now mainly reproduces asexually, as already demonstrated for Australian grape phylloxera populations. Despite asexual reproduction, all examined populations revealed a high grade of genotypic diversity. The reports on the emergence of new and more aggressive strains raised the question, how a population composed of asexually reproducing organisms would change and adapt to such an extent. Using a multilocus marker system, eight single founder lineages were genetically monitored over at least 15 generations. All lineages revealed a high grade of intraclonal variation. Sequencing of polymorphic fragments showed, that the genetic variation was not due to contaminating plant or bacterial DNA, but was due to variation within the insect genome. Furthermore, mutations occured already in early generations and were not observed to accumulate in later generations. Mutations were rather generated constantly and only few mutation specific markers were identified to be stable over all following generations. The here documentated genetic variation reveals the great adaptational potential of this insect pest. The adaptability of single founder lineages was further assessed by measuring physiological parameters in single isolation chambers in the greenhouse. Parameters as the number of surviving individuals per generation, the number of eggs or the number of ovarioles per generation exposed differences in performance among the lineages and also within the lineages a high grade of intraclonal variation. A direct correlation of specific multilocus markers and particularly adapted individuals or lineages was not possible in this assay. Two markers, though, were observed to occure in several lineages which performed well on the new host plant. These markers may be a first step to the development of adaptation-related markers and need to be tested on further populations and host plants. When analysing intraclonal variation, the question of putative contaminating factors within the system arises. Symbiotic bacteria occuring in nearly all aphid species certainly are the first to be suspected as a source of genetic variation among single individuals tested. Endosymbiotic bacteria, as Buchnera aphidicola in other aphid species, influencing nutritional condition and fitness of the insect population, were not identified in D. vitifoliae. A bacterium, closely related to Pantoea agglomerans, however, was identified in several grape phylloxera populations, using universal 16S rDNA primers and later specifically developed markers, which were also employed for in situ hybridization. The bacterium was localized in the salivary pump of D. vitifoliae. PCR analysis of in vitro reared populations revealed that the bacterium is present in root- and leaf-feeding parthenogenetic populations of grape phylloxera and, moreover, seems to be transmitted from generation to generation. In other insect species, this bacterium has been demonstrated to produce antifungal and antibacterial substances, which were also found in first in vitro tests with grape phylloxera associated bacteria. The insect may benefit from the antagonistic potential of these bacteria. P. agglomerans may be a further participant in the certainly complex interaction of grape phylloxera and grapevine. This thesis represents a broad approach to elucidate the development of grape phylloxera populations in Europe. Using new molecular marker systems, it has become possible to gain more information on the genetic structure of the insect and its adaptational potential. The predominant clonal reproduction mode of the insect confronts grapevine breeders and pest management with the task to continously develop new resistant rootstocks and to keep up with new pest management systems.

Die Reblaus (Daktulosphaira vitifoliae Fitch; Homoptera: Phylloxeridae) ist ein wirtschaftlich bedeutender Schädling in allen weltweiten Weinbauregionen. Das aus Nordamerika stammende Insekt wurde Mitte des 19. Jahrhunderts nach Europa verschleppt und breitete sich rasant in allen europäischen Weinbaugebieten aus. Erst die Einführung von Pfropfreben - die Verbindung europäischer Edelreiser mit amerikanischen, wurzelresistenten Unterlagen - machte es möglich, die Rebflächen sicher wieder aufzureben. Die Reblaus ist trotzdem auch heute noch im Weinbau präsent. Sie vermehrt sich insbesondere an ausgetriebenen Unterlagen (sogenannten Drieschen) und in Unterlagsschnittgärten. Ausserdem wurde in den letzten Jahrzehnten häufiger vom Befall bisher als resistent eingestufter Unterlagen neuen und aggressiveren Reblausstämmen berichtet. Reblauspopulationen scheinen in Hinsicht auf ihre Wirtsanpassungsfähigkeit und ihre genetische Zusammensetzung sehr variabel zu sein. Der im 19. Jahrhundert beschriebene Lebenszyklus entspricht sicher nicht mehr den aktuellen Gegebenheiten. Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war daher, die genetische Struktur europäischer Reblauspopulationen mit Hilfe genetischer Marker neu zu definieren. Es zeigte sich, wie auch schon in anderen Weinbaugebieten, z.B. Australien nachgewiesen, dass sich die Reblaus vorwiegend asexuell vermehrt und nicht mehr den klassischen holozyklischen Lebenszyklus aufweist. Trotz der klonalen Vermehrungsweise konnte in den untersuchten Populationen eine sehr grosse genotypische Diversität nachgewiesen werden. Die Verbreitung neuer und agressiverer Stämme warf die Frage auf, wie sich eine aus klonalen Organismen bestehende Population derart schnell verändern und anpassen kann. Mit Hilfe eines Multilocus-Markersystems wurden klonale Linien über mindestens 15 Generationen genetisch analysiert. Alle Linien zeigten einen hohen Grad an intraklonaler genetischer Variation. Die Sequenzierungen polymorpher Fragmente zeigten, dass die genetischen Unterschiede innerhalb eines Klons nicht von kontaminierender bakterieller oder pflanzlicher DNS herrührten, sondern insekteneigene, genetische Variationen darstellten. Weiterhin wurde festgestellt, dass sich die bereits in frühen Generationen auftretenden Mutationen zum grossen Teil nicht bis in spätere Generationen akkumulierten. Vielmehr wurden kontinuierlich neue Mutationen generiert und nur einige wenige etablierten sich fest in den folgenden Generationen. Die hier zum ersten Mal auf diese Weise dokumentierte genetische Variabilität klonaler Reblauslinien macht das Adaptationspotential dieses Schädlings deutlich. Die Anpassungsfähigkeit einzelner klonaler Linien wurde zusätzlich mit Hilfe von einfach messbaren physiologischen Parametern im Gewächshaus ermittelt. An Parametern, wie der Anzahl überlebender Individuen pro Generation, der Anzahl Eier oder auch der Anzahl Ovariolen konnte eine intraklonale Variation bei klonalen Linien nachgewiesen werden. Die Identifikation zweier häufig auftretender Marker ist ein erster Schritt zur Entwicklung adaptationsspezifischer Marker, die dann an weiteren Populationen getestet werden sollen. Bei der Analyse intraklonaler Variation liegt die Vermutung nahe, dass symbiontische Bakterien, wie sie bei fast allen Aphiden vorkommen, eine wichtige Kontaminationsquelle sein könnten. Endosymbiontische Bakterien, wie Buchnera aphidicola bei anderen Blattlausarten, welche direkten Einfluss auf Ernährung und Fitness der Insektenpopulationen haben, konnten bei der Reblaus nicht identifiziert werden. Jedoch wurde ein dem Bakterium Pantoea agglomerans nah verwandtes Bakterium in allen untersuchten Reblauspopulationen nachgewiesen. Das Bakterium wurde in der Speichelpumpe von D. vitifoliae lokalisiert. PCR Analysen von in vitro Populationen zeigten, dass das Bakterium nicht nur in Blattpopulationen, sondern auch bei Wurzelläusen vorkommt und von Generation zu Generation übertragen wird. In anderen Insektenarten konnte eine antifungale und antibakterieller Funktion bereits nachgewiesen werden. Erste in vitro Tests bestätigten dies auch für das hier identifizierte Bakterium. Es ist vorstellbar, dass die Reblaus vom antagonistischen Potential dieses Bakteriums profitiert. P. agglomerans könnte somit ein weiterer interessanter Faktor in der komplexen Rebe-Reblaus Interaktion sein. Die vorliegende Arbeit stellt einen Ansatz zur Aufklärung des Verhaltens klonaler Reblauspopulationen in Europa dar. Mit Hilfe neuer molekularer Methoden ist es möglich geworden, neue Informationen zur genetischen Struktur dieses Schadinsekts zu gewinnen und seine Anpassungsfähigkeit zu beobachten. Die klonale Vermehrungsweise stellt den Rebschutz vor die Aufgabe, das Verhalten dieses sich rasant entwickelnden Schädlings genau zu beobachten und die Entwicklung resistenter Unterlagen und neuer Pflanzenschutzmassnahmen voranzutreiben.