Investigations on the mechanisms of sterilization by non-thermal low-pressure nitrogen-oxygen plasmas

Abstract

Plastic based materials are increasingly used for packaging of pharmaceuticals (especially biologicals), food or beverages and production of medical devices. Their heat sensitivity requires safe and efficient non-thermal methods for decontamination. Plasma technology has the potential to provide a suitable means since it works at low temperatures and ? in contrast to conventional methods like application of ionizing radiation or ethylene oxide exposure ? is safe to operate, is free of residues and does not alter the bulk properties of the materials. Plasmas can generate various agents potentially active in decontamination like ultra-violet (UV) radiation, radicals and other reactive particles. To acquire an approval for plasma technology as a novel sterilization method, its process safety has to be proven. The research community has proposed hypotheses and models on its mechanisms of action, which are at least partially speculative. Still little is known about the details of the biologic effects of the combination of the various plasma agents on the components of microbial cells or spores. Especially, the question remains open which components of a cell or spore are the primary targets, and which of the agents are most effective in the inactivation process. The acquisition of such knowledge is necessary to identify parameters suitable to control, monitor, and assess the safety of plasma sterilization processes. The aims of the presented work are to elucidate which components of a cell or spore are the primary targets in low-pressure plasma sterilization, and which of the putative agents contained in the plasma are most effective in the inactivation process. To accomplish this, in the presented work suitable microbiological methods were established and the inactivation of bacterial spores and cells and fungal conidia by microwave induced low-pressure low-temperature nitrogen-oxygen plasmas was investigated. Moreover, two strategies were pursued that have hitherto not been applied in published plasma sterilization studies: (i) Using spores of Bacillus subtilis mutants to identify structural components serving as targets for sterilization with plasma and (ii) characterizing the response of Deinococcus radiodurans R1 cells to plasma treatment and identify repair processes during recovery from plasma induced damages in viable cells. Plasmas producing a maximum of UV emission were most effective in inactivating bacterial cells and spores. The inactivation followed a biphasic kinetics consisting of a log-linear phase with rapid inactivation followed by a slow inactivation phase. A continuous model fit was applied to the experimental data allowing reliable calculation of decimal reduction values for both phases. Cells of D. radiodurans were found to be more resistant than spores of B. subtilis. For B. subtilis spores, in the course of plasma treatment damage to DNA, proteins and spore membranes were observed by monitoring the occurrence of auxotrophic mutants, inactivation of catalase (KatX) activity and the leakage of dipicolinic acid, respectively. Spores of the wild-type strain showed highest resistance to plasma treatment. Spores of mutants defective in nucleotide excision repair (uvrA) and small acid-soluble proteins (ΔsspA ΔsspB) were more sensitive than those defective in the coat protein CotE or spore photoproduct repair (splB). Exclusion of reactive particles and spectral fractions of UV radiation from access to the spores revealed that UV-C radiation is the most effective inactivation agent in the plasma, whereby the splB and ΔcotE mutant spores were equally and slightly less sensitive, respectively, than the wild-type spores. The extent of damages in the spore DNA as determined by quantitative PCR correlated with the spore inactivation. Spore inactivation was effectively mediated by a combination of DNA damage and protein inactivation. DNA was identified to be the primary target for spore inactivation by UV radiation emitted by the plasma. Coat proteins were found to constitute a protective layer against the action of the plasma. For the investigation of the recovery from plasma-induced damages, cells of D. radiodurans R1 were subjected to short plasma treatments with various plasmas. A part of the survivors was sublethally injured as determined by their ability to form colonies on standard medium but not on stress medium and by the observation of a prolonged lag phase. Incubation of the cells in a recovery medium after plasma treatment allowed a part of the survivors to recover their ability to grow on stress medium. This recovery strongly depended on transcriptional and translational processes and cell wall synthesis, as revealed by addition of specific inhibitors to the recovery medium. Genes involved in DNA repair, oxidative stress response and cell wall synthesis were induced during recovery, as determined by quantitative RT-PCR. Damage to chromosomal DNA caused by plasma agents and in-vivo repair during recovery was directly shown by quantitative PCR. Plasmas with less UV radiation emission were also effective in killing D. radiodurans cells but resulted in less DNA damage and lower induction of the investigated genes. The response of D. radiodurans to plasma indicated that DNA, proteins and cell wall are primary targets of plasma, whose damage initially leads to the cells' death. Protein oxidation was more important for the killing of D. radiodurans cells than of B. subtilis spores. Thus, the plasma process parameters must regard the expected contaminating biological material in order to obtain a high-level sterilization. The results provide new insight into the interaction of non-thermal low-pressure plasmas with microorganisms. This knowledge supports the definition of suitable parameters for novel plasma sterilization equipment to control process safety. For example, monitoring the UV intensity below 280 nm and spectrometric online measurement of bands related to excited reactive gas particle species during the process is recommended.

Polymerbasierte Materialien werden zunehmend für die Verpackung von Arzneimitteln (vor allem für Biologika), Lebensmittel oder Getränke und die Produktion von medizinischen Geräten eingesetzt. Ihre Hitzeempfindlichkeit erfordert sichere und effiziente nicht-thermische Dekontaminationsverfahren. Die Plasmatechnologie hat das Potenzial, solchen Anforderungen gerecht zu werden, da sie bei niedrigen Temperaturen arbeitet und ? im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie ionisierende Bestrahlung oder Ethylenoxidbegasung ? sicher zu bedienen ist, keine Rückstände hinterlässt und keine Veränderungen an den Volumeneigenschaften der Materialien hervorruft. Plasmen können verschiedene Agenzien erzeugen, die potenziell für die Dekontamination aktiv sind, zum Beispiel ultraviolette (UV) Strahlung, Radikale und andere reaktive Teilchen. Um eine Zulassung für ein neuartiges Plasma-Sterilisationsverfahren zu erlangen, muss dessen Prozesssicherheit nachgewiesen werden. Einschlägig tätige Forschungsgruppen haben Hypothesen und Modelle für die Wirkmechanismen der Plasmasterilisation vorgeschlagen, die teilweise noch spekulativ sind. Bisher sind kaum Details über die biologische Auswirkung der Kombination von verschiedenen Plasma-Agenzien auf die Komponenten von mikrobiellen Zellen oder Sporen bekannt. Insbesondere bleibt die Frage offen, welche Komponenten einer Zelle oder Spore die primären Wirkorte sind, und welche der Agenzien am effektivsten sind. Diese Kenntnisse sind notwendig, um geeignete Parameter zur Steuerung, Überwachung und Bewertung der Sicherheit von Plasma-Sterilisationsprozessen zu ermitteln. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Aufklärung, welche der Komponenten einer Zelle oder Spore die primären Wirkorte bei der Niederdruck-Plasmasterilisation sind, und welche der im Plasma enthaltenen Agenzien am effektivsten bei der Inaktivierung von Mikroorganismen sind. Hierfür wurden in der vorliegenden Arbeit geeignete mikrobiologische Methoden evaluiert und etabliert und die Inaktivierung von bakteriellen Sporen und Zellen sowie Schimmelpilzkonidien durch mikrowelleninduzierte Niederdruck-Niedertemperatur-Stickstoff-Sauerstoff-Plasmen untersucht. Weiterhin wurden zwei Strategien verfolgt, die bisher noch nicht in veröffentlichten Arbeiten zur Plasmasterilisation verwendet worden sind: (i) Verwendung von Sporen von Bacillus subtilis-Mutanten zur gezielten Untersuchung von Komponenten, die als Wirkorte für die Plasmasterilisation in Frage kommen. Und (ii), Charakterisierung der Reaktion von Deinococcus radiodurans R1 Zellen auf verschiedene Plasmabehandlungen, um biologische Prozesse in lebenden Zellen zu identifizieren, die bei der Reparatur von plasmainduzierten Schäden eine Rolle spielen. Plasmen, die eine maximale UV-Emission erzeugen, waren am effektivsten bei der Inaktivierung von Bakterienzellen und Sporen. Die Inaktivierung folgte einer biphasischen Kinetik, die sich aus einer log-linearen Phase schneller Inaktivierung gefolgt von einer Phase langsamer Inaktivierung zusammensetzt. Für die experimentell ermittelten Datenpunkte wurde eine Kurvenanpassung mit einem stetigen biphasischen Modell durchgeführt. Dies ermöglichte die zuverlässige Berechnung von dezimalen Reduktionswerten (D-Werte) für beide Phasen. Dabei erwiesen sich Zellen von D. radiodurans R1 als resistenter als Sporen von B. subtilis. Während der Plasmabehandlung von B. subtilis Sporen wurde das Auftreten auxotropher Mutanten, die Inaktivierung der Katalase (KatX)-Aktivität sowie die Freisetzung von Dipicolinsäure untersucht. Dabei wurden Schäden an der DNA, an Proteinen beziehungsweise an den Sporenmembranen beobachtet. Sporen des Wildtyp-Stamms wiesen die höchste Resistenz gegen Plasmabehandlung auf. Sporen von Stämmen mit Mutationen an einem DNA-Reparatursystem (uvrA) und bei der Synthese der DNA-bindenden Proteine SASP (ΔsspA ΔsspB) waren empfindlicher als Sporen mit veränderter Coat-Schicht (cotE) oder als solche, denen ein funktionierendes Enzym zur direkten Reparatur des Spore-Photoproduct (splB) fehlt. Eine Abschirmung der Sporen vor reaktiven Teilchen und Teilen des UV-Spektrums zeigte, dass die UV-C Strahlung das effektivste Agens für die Inaktivierung im Plasma ist. Im Vergleich zu Wildtyp-Sporen erwiesen sich dabei die Sporen der Mutanten splB als gleich und ΔcotE als etwas weniger empfindlich. Das Ausmaß der Schäden in der Sporen-DNA wurde mittels quantitativer PCR bestimmt und korrelierte mit der Inaktivierung der Sporen. Die Inaktivierung von Sporen wurde effektiv durch eine Kombination aus DNA-Schädigung und Proteininaktivierung bewirkt. Die DNA wurde als primärer Wirkort für die Sporeninaktivierung durch im Plasma erzeugte UV-Strahlung identifiziert. Die Coat-Schicht der Sporen bildet eine Schutzschicht gegen die Wirkung des Plasmas. Um die Reparatur von plasmainduzierten Schäden zu untersuchen, wurden Zellen von D. radiodurans R1 kurzen Behandlungen mit unterschiedlichen Plasmen unterzogen. Ein Teil der Überlebenden konnte Kolonien auf Standard-Medium, nicht aber auf Stressmedium bilden, wobei zusätzlich eine verlängerte Lag-Phase beoabachtet wurde. Diese Überlebenden wurden als subletal geschädigt gewertet. Durch Inkubation der Zellen in einem Recovery-Medium konnte ein Teil der Überlebenden sich so weit erholen, dass sie ihre Fähigkeit, auf Stressmedium zu wachsen, wieder erlangten. Diese Erholung war maßgeblich abhängig von Transkriptions- und Translationsprozessen sowie von der Zellwandsynthese. Dies zeigte sich durch die Zugabe von entsprechenden spezifischen Inhibitoren zum Recoverymedium. Eine Analyse mittels quantitativer RT-PCR zeigte, dass Gene während der Erholungsphase induziert waren, die an der DNA-Reparatur, an der Resistenz gegen oxidativen Stress sowie an der Zellwandsynthese beteiligt sind. Sowohl durch das Plasma verursachte Schäden an chromosomaler DNA als auch deren Reparatur in-vivo während der Erholungsphase wurden durch direkte Messung mit quantitativer PCR demonstriert. Plasmen mit weniger UV-Emission waren ebenfalls effektiv bei der Abtötung von D. radiodurans Zellen, sie erzeugten jedoch weniger DNA-Schädigung und eine niedrigere Induktion der untersuchten Gene. Das Verhalten von D. radiodurans Zellen nach Plasmabehandlung weist darauf hin, dass die DNA, Proteine und Zellwand primäre Wirkorte des Plasmas sind, deren Schädigung zuerst zum Absterben der Zellen führt. Die Proteinoxidation hatte mehr Einfluss auf die Sterilisation von D. radiodurans Zellen als bei B. subtilis Sporen. Die Auslegung der Plasmaprozesse muss folglich die Art des in der jeweiligen Anwendung zu erwartenden kontaminierenden biologischen Materials berücksichtigen, um eine hohe Sterilisationssicherheit zu erzielen. Die Ergebnisse liefern neue Einblicke in die Wechselwirkungen von nicht-thermischen Niederdruck-Plasmen mit Mikroorganismen. Dieses Wissen unterstützt die Definition von geeigneten Parametern für neuartige Plasma-Sterilisationsanlagen zur Kontrolle der Prozesssicherheit. Zum Beispiel ist eine Überwachung der UV-Intensität unterhalb von 280 nm sowie eine spektrometrische Online-Messung von Emissionsbanden angeregter reaktiver Teilchen während des Prozesses zu empfehlen.