Nachweis von luftgetragenen Viren an Standorten der Abfall- und Abwasserentsorgung

Abstract

In this study, aerosols workers at waste and wastewater treatment plants were exposed to, were examined with regard to the presence of airborne human pathogenic viruses. Besides the detection of hepatitis B virus and hantaviruses the main issue was to detect hepatitis A virus, rotavirus, human enteroviruses and poliovirus.

Airborne viruses were sampled in parallel with different bioaerosol samplers, using various physical collection methods. At selected locations, measurements with two special-impingers, the MD 8-sampler and two high-volume-samplers were performed. Personal exposition of waste treatment workers to aerosols was measured using the PGP-GSP-system.

Before viruses could be detected, the air samples had to be prepared. Because of the different sampling methods, several protocols had to be established. For the purification and concentration of the collected virus particles the following methods were used: prefiltration, ultrafiltration (100 and 500 KD), density gradient ultrafiltration using a sucrose gradient and the digestion of gelatine with trypsin.

After these sampling processing procedures the virus detection and quantification of the samples of the special-impingers, the MD 8-sampler and the high-volume-samplers were assayed for human enteroviruses and rotavirus using four different tissue cultures (VERO, BGM, A549 and MA104) and molecular biological methods (RT-nested-PCR). For all other viruses only molecular biological methods (PCR) were applied. Regarding to the low flow-rate of the PGP-GSP-System only PCR was taken for virus detection.

For the detection of viruses using the PCR assay, four different commercially available extraction-kits for DNA and RNA were compared. For all viruses besides hantavirus, several nested-PCR-systems for the qualitative and quantitative (using externe standards) determination with the LightCycler technique were established. To get informations about the attitude of a possible inhibition of the PCR reaction, the prepared samples were seeded with defined amounts of equine rhinovirus and amplified with an external standard on the LightCycler. The established PCR assays for hantavirus, hepatitis A virus, human enteroviruses and poliovirus showed a higher sensitivity (to be more sensitive) than the used cell culture. For detecting rotavirus, the sensitivity of both assays were equal, the detection limit for the nested-PCR of hepatitis B virus was one gencopy per reaction.

In none of the 144 aerosol samples (45 PGP-GSP-samples and 99 from the other samplers) rotavirus, hepatitis A virus, hepatitis B virus and hantaviruses could be detected with the PCR technology. Also no rotavirus was isolated with the tissue culture method. In 21 cases the PCR showed positive results for human enterovirus RNA, the calculated concentration ranged from Äq. 100,47 KID50/ml to Äq. 103,74 KID50/ml. Viral infectivity could be demonstrated in 33 out of 99 examined specimens after inoculation on several cell cultures. The virus concentration ranged from 100,7 KID50/ml to more than 103,7 KID50/ml. After plaque purification some of the isolates were sequenced and identified as poliovirus type 1.

In conclusion, the results of these studies indicate that at the investigated locations high measurable levels of hepatitis A virus, hantavirus, rotavirus and hepatitis B virus can not be expected. Nevertheless, in some special cases contamination might be possible. The detection of human enterovirus in 21 % of the location-based samples shows that especially bioaerosols at the waste water treatment plants might possibly be contaminated with viruses. Therefore the risk of infections can not be excluded.

In der vorliegenden Arbeit wurde an zehn verschiedenen Standorten der Abwasser- und Müllentsorgung die Luft auf das Vorhandensein von potentiell humanpathogenen Viren untersucht. Neben dem Nachweis von Hepatitis B-Virus und Hantaviren stand dabei vor allem die Suche nach Hepatitis A-Virus, Rotaviren, humanen Enteroviren und Poliovirus im Vordergrund.

Zur Sammlung luftgetragener Viren wurden mehrere Luftkeimsammler parallel eingesetzt, die nach unterschiedlichen physikalischen Prinzipien Partikel abscheiden. Für standortbezogene Messungen waren die zwei Spezial-Impinger, der MD 8-Sammler und zwei ?high-volume?-Sammler. Die personenbezogenen Messungen wurden mit dem personengetragenen Gefahrstoff-Probenahmesystem (PGP-GSP-System) durchgeführt, mit dem die Exposition einzelner Arbeitnehmer während ihrer Tätigkeit untersucht werden sollte.

Die gesammelten Luftproben wurden vor dem eigentlichen Erregernachweis aufgearbeitet. Da die Proben, bedingt durch die verwendeten Sammelgeräte und deren Abscheideprinzipien in unterschiedlicher Form vorlagen, wurden hierzu verschiedene geeignete Protokolle etabliert. Für die Aufarbeitung der gesammelten Luftproben kamen folgende Methoden zur Anwendung: Vorfiltration, Ultrafiltrationen (100 und 500 KD), Dichtegradientenultrazentrifugation mit Saccharosegradienten und der Verdau von Gelatine mit Trypsin.

Im Anschluss an die Probenaufarbeitung erfolgte die Virusdetektion und -quantifizierung aus den standortbezogenen Luftproben für humane Enteroviren und Rotaviren sowohl über die kulturelle Anzucht in vier verschiedenen Zellsystemen (VERO, BGM, A549 und MA104) als auch unter Verwendung molekularbiologischer Methoden (RT-nested-PCR). Der Virusnachweis aller weiteren Erreger wurde nur molekularbiologisch (PCR) durchgeführt. Aufgrund des geringen Luftdurchsatzes des PGP-GSP-Systems wurden alle Proben der personenbezogenen Messungen nur mittels der PCR untersucht.

Für den PCR-Nachweis der Viren wurden vier unterschiedliche Extraktionskits zur parallelen Isolierung von DNA und RNA getestet und, mit Ausnahme des Nachweises von Hantaviren, einzelne nested-PCR-Systeme zum qualitativen und quantitativen Virusnachweis mittels externer Standards im LightCycler etabliert. Weiterhin wurde für die Untersuchung ein System entwickelt, mit dem eine mögliche Inhibition des PCR-Nachweises aus den Luftproben über die Wiederfindung eines zugesetzten Virusspikes überprüft wurde. Für humane Enteroviren, Poliovirus, Hepatitis A-Virus und Hantaviren wurden sehr empfindliche RT-nested-PCR-Systeme etabliert, die sich als empfindlicher als die im Labor verwendete kulturelle Virusisolierung erwiesen. Die Sensitivität des molekularbiologischen Nachweises von Rotaviren entsprach der kulturellen Virusisolierung. Der PCR-Nachweis von Hepatitis B-Virus hatte eine Nachweisgrenze von einer Genkopie pro PCR-Anastz.

Die Untersuchung von 144 Luftproben (99 standortbezogene und 45 personenbezogene Proben) zeigte, dass in keiner der Proben Hepatitis A-Virus, Hepatitis B-Virus, Hantaviren und Rotaviren unter Verwendung der etablierten nested-PCR-Systeme detektiert werden konnte. Die kulturelle Isolierung von Rotaviren war ebenfalls aus keiner der Proben möglich. Beim molekularbiologischen Nachweis von humanen Enteroviren ergaben sich für 21 Luftproben positive Resultate, wobei anhand des externen Standards Viruskonzentrationen in der Sammelflüssigkeit von Äq. 100,47 KID50/ml bis Äq. 103,74 KID50/ml ermittelt wurden. Der Nachweis von Poliovirus gelang in sechs der untersuchten Luftproben. Die kulturelle Virusisolierung war aus 33 von 99 untersuchten Proben erfolgreich. Es wurden dabei Viruskonzen- trationen zwischen 100,7 KID50/ml und mehr als 103,7 KID50/ml bestimmt. Die Sequenzierung einiger Plaque-gereinigter Isolate ergab, dass es sich bei allen Isolaten um Poliovirus vom Typ 1 handelte.

Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchung deuten darauf hin, dass an den untersuchten Standorten mit einer Belastung der Luft mit Hepatitis A-Virus, Hantaviren, Rotaviren und Hepatitis B-Virus in hohem Umfang nicht zu rechnen ist, wobei eine Kontamination in einzelnen Fällen nicht vollständig auszuschließen ist. Der Nachweis von humanen Enteroviren in 21 % der untersuchten standortbezogenen Proben macht hingegen deutlich, dass vor allem im Bereich der Abwasserentsorgung mit einer Virusbelastung der Umgebungsluft zu rechnen ist. Die Möglichkeit einer Infektion kann daher nicht ausgeschlossen werden.