Studies of phytate degradation and associated mineral utilization in growing pigs

Abstract

Phosphorus (P) is primarily stored in plant seeds as phytate, which is any salt of phytic acid (myo-inositol hexakisphosphate; InsP6). The enzymatic capacity of pigs and the microorganisms present in their digestive tract allows for only partial and incomplete prececal degradation of InsP6. To address this limitation, the addition of exogenous phytases to feed has been state-of-the-art for more than three decades. Phytases, found in various organisms like bacteria, fungi, plants, and animals, initiate the breakdown of InsP6 and inorganic phosphate, thereby making the liberated phosphate available for digestion. Substantial scientific research and practical field applications have shown that adding exogenous phytases to the diet of non-ruminants leads to an improvement in P digestibility and a reduction in P excretion. Over time, phytases with enhanced thermal profiles and higher activity at physiological pH milieus have been engineered. Additionally, advancements in plant breeding have increased intrinsic phytase activity in feed ingredients relevant to animal nutrition. Thus, this thesis aimed to deepen the understanding of inositol phosphate (InsP) degradation in ileal-cannulated pigs, focusing on how dietary variables can influence this process along the digestive tract. In the first study (Manuscript 1), diets based on wheat with variable intrinsic phytase activity and the addition of an exogenous phytase on InsP degradation in pigs were investigated. Although wheat intrinsic phytase contributed to increased InsP degradation and P digestibility in pigs, variation in intrinsic phytase activity by crossbreeding wheat, as achieved in this study, was not reflected in InsP degradation and P digestibility data. This discrepancy may be attributed to an inadequate proteolytic resistance of wheat phytase in the gastric compartment of the pig. A marked increase in prececal InsP degradation and P digestibility was achieved by adding a microbial phytase to the wheat-based feed. While exogenous phytase increases the digestibility of InsP-P, other dietary components may impair its hydrolytic activity. In the second study (Manuscript 2), the single and interactive effects of dietary Ca concentration and exogenous phytase in pigs were investigated. The study assessed the effects of dietary Ca and exogenous phytase on InsP degradation and nutrient digestibility in growing pigs. Additional dietary Ca decreased prececal InsP6 disappearance, but only with exogenous phytase. Concentrations of lower InsP isomers and myo-inositol in the ileal digesta and prececal P digestibility were greater with exogenous phytase, but not affected by dietary Ca concentration. In contrast, fecal InsP6 disappearance was lower and the concentration of InsP4-5 isomers in feces was greater with additional dietary Ca. The study revealed that dietary Ca concentration is relevant for InsP disappearance in the hindgut, but not in the ileum. However, when exogenous phytase is used, the dietary Ca concentration is important because prececal InsP degradation is affected by the Ca level in the diet. The third study (Manuscript 3) aimed to investigate the effects of dietary Ca sources, exogenous phytase, and formic acid on InsP degradation and nutrient digestibility in growing pigs. Replacing limestone with Ca formate reduced prececal InsP6 disappearance and prececal P digestibility. However, adding formic acid to a diet containing limestone and phytase enhanced prececal InsP6 disappearance and increased InsP2 and myo-inositol concentrations in the distal ileal digesta. Accordingly, prececal P digestibility was increased when formic acid was added to the diet containing limestone and exogenous phytase. This suggested that Ca formate is not a suitable alternative Ca source to limestone for optimizing prececal P release from InsP in growing pigs. The release of P from InsP by exogenous phytase in limestone diets can still be further increased by adding formic acid. In conclusion, the degradation of InsP in growing pigs is a complex process affected by dietary Ca concentration, dietary Ca source, and the presence of phytase. However, investigated dietary traits mainly affected InsP6, with lesser effects on lower InsP isomers, highlighting the importance of prececal hydrolytic breakdown of InsP6 to InsP5. This directly affected P digestibility of growing pigs. Intrinsic phytase activity in feed ingredients, such as wheat, can contribute to prececal InsP degradation but may be neglected when exogenous phytase is present in the feed. Exogenous phytase addition notably increased prececal InsP degradation and P digestibility in plant-based diets, and complete dephosphorylation of InsP in the prececal tract was implied by the increase of the final degradation product myo-inositol in the ileum content, urine, and blood. However, some P remained bound to InsP at the end of the ileum of growing pigs and was therefore not available for digestion. Nevertheless, some diets with exogenous phytase tested in this thesis met the recommended digestible P concentration. This suggests that diets formulated with adequate InsP-containing ingredients and exogenous phytase may obviate the need for mineral P addition, reducing the reliance on finite P sources in growing pig nutrition.

Phosphor (P) wird in Getreide und anderen für die Schweinernährung relevanten Futterpflanzen hauptsächlich in Form von Phytat gespeichert. Phytat ist das Salz der Phytinsäure (myo-Inositol Hexakisphosphat; InsP6). Die initiale Hydrolyse von InsP6 zu InsP5 ist bis zum Ende des Dünndarms (praecaecal) von Schweinen sehr begrenzt. Deshalb werden bereits seit drei Jahrzehnten exogene Phytasen in der Ernährung von Nicht-Wiederkäuern eingesetzt. Phytasen sind eine Enzymgruppe innerhalb der Phosphatasen und in der Lage, den Abbau von InsP6 zu initiieren. Der dadurch freigesetzte Phosphatrest steht dann zur Verdauung zur Verfügung. Die Forschung und praktische Anwendungen seit der Einführung der ersten kommerziellen Phytase im Jahr 1991 haben gezeigt, dass die Zugabe von exogenen Phytasen die P-Verdaulichkeit von Nicht-Wiederkäuern verbessert und somit die Ausscheidung von P reduziert. Im Laufe der Zeit kamen weitere exogene Phytasen auf den Markt, welche sich in ihren Eigenschaften wie Thermostabilität oder Enzymaktivität bei physiologischem pH unterscheiden. Darüber hinaus haben Fortschritte in der Pflanzenzüchtung die intrinsische Phytaseaktivität von relevanten Futtermitteln erhöhen können. Ziel dieser Arbeit war es daher, das Verständnis für den Abbau von Inositolphosphaten (InsP) bei ileal-kanülierten Schweinen tiefgehend zu untersuchen und herauszufinden, wie dieser Abbauprozess entlang des Verdauungstraktes durch andere Nahrungsbestandteile beeinflusst wird. In der ersten Studie (Manuskript 1) wurde untersucht, wie sich Weizen mit unterschied-lich hoher intrinsischer Phytaseaktivität auf den Abbau von InsP auswirkt und wie dies durch die Zugabe einer exogenen Phytase bei Schweinen beeinflusst wird. Obwohl die intrinsische Phytase des Weizens zu einem erhöhten InsP-Abbau und einer höheren P-Verdaulichkeit bei Schweinen beitrug, spiegelte sich die unterschiedlich hohe intrinsische Phytaseaktivität der geprüften Genotypen nicht im InsP-Abbau und der P-Verdaulichkeit wider. Diese Diskrepanz könnte auf die nicht vorhandene Adaption der Weizenphytase an den vorherrschenden pH-Wert im Magen der Schweine sowie auf die geringe proteolytische Resistenz zurückzuführen sein. Durch Zugabe einer exogenen Phytase konnte eine deutliche Steigerung des praecaecalen InsP-Abbaus und der P-Verdaulichkeit erzielt werden. Exogene Phytasen erhöhen den Abbau von InsP, jedoch kann die hydrolytische Aktivität durch andere Nahrungsbestandteile beeinträchtigt werden, was zu einer verringerten InsP-Aufspaltung führt. In der zweiten Studie (Manuskript 2) wurden Einzel- und Wechsel¬wirkungen der Ca-Konzentration und exogenen Phytase in der Futtermischung bei Schweinen untersucht. Von besonderem Interesse war dabei der Einfluss dieser beiden Variablen auf den InsP-Abbau und die damit assoziierte Nährstoffverdaulichkeit bei wachsenden Schweinen. Die höhere Ca-Konzentration im Futter verringerte das praecaecale Verschwinden von InsP6, allerdings nur in Kombination mit exogener Phytase. Die Konzentration niederer InsP-Isomere und von myo-Inositol in der Ileumdigesta sowie die praecaecale P-Verdaulichkeit waren bei Zugabe von exogener Phytase höher, unabhängig von der Ca-Konzentration im Futter. Im Gegensatz dazu war die Konzentration von InsP6 und von InsP4 und InsP5 Isomeren höher bei höherer Ca-Konzentration im Futter, unabhängig von exogener Phytase. Die Studie zeigte, dass die Ca-Konzentration im Futter zwar für den InsP-Abbau im Dickdarm relevant ist, jedoch nicht praecaecal, zumindest wenn keine exogene Phytase eingesetzt wird. Wenn jedoch exogene Phytase verwendet wird, ist die Höhe der Ca-Konzentration im Futter wichtig, da der praecaecale InsP-Abbau sonst niedriger ausfällt. In der dritten Studie (Manuskript 3) wurde bei wachsenden Schweinen der Einfluss von Ca-Quellen, exogener Phytase und Ameisensäure im Futter auf den InsP-Abbau und die damit verbundene Nutzung der Nährstoffe untersucht. Der Austausch von Ca-Carbonat durch Ca-Formiat verringerte das praecaecale Verschwinden von InsP6 und die P-Verdaulichkeit. Der Zusatz der Ameisensäure im Futter mit Ca-Carbonat und exogener Phytase erhöhte dagegen das praecaecale Verschwinden von InsP6, sowie die Konzentration von InsP2 und myo-Inositol am Ende des Dünndarms. Der praecaecale Effekt der Ameisensäure auf die InsP-Isomere führte zudem zu einer höheren P-Verdaulichkeit im Vergleich zur Ration ohne Ameisensäure. Die Studie zeigte, das Ca-Formiat bei heranwachsenden Schweinen keine geeignete Alternative zu Ca-Carbonat ist, um den InsP-Abbau bis zum Ende des Dünndarms zu steigern. Die Zugabe von Ameisensäure kann dazu beitragen, den Abbau von InsP in Ca-Carbonat-haltigen Rationen mit exogener Phytase weiter zu steigern und so die praecaecale P-Verdaulichkeit zu erhöhen. Der Abbau von InsP im Verdauungstrakt von wachsenden Schweinen ist ein komplexer Prozess, der durch die Ca-Konzentration, die Ca-Quelle und exogene Phytase im Futter beeinflusst wird. Dabei war in diesen Studien hauptsächlich der Abbau von InsP6 betroffen, wohingegen Effekte auf die niederen InsP-Isomere geringer waren. Dies unterstreicht die Bedeutung des initialen Abbauschrittes von InsP6 zu InsP5, weil es unmittelbar die P-Verdaulichkeit beeinflusst. Die intrinsische Phytaseaktivität von Weizen kann zum praecaecalen InsP-Abbau beitragen. Dies ist jedoch von untergeordneter Bedeutung, wenn dem Futter exogene Phytase zugesetzt wird. Die Zugabe exogener Phytase erhöhte deutlich den praecaecalen InsP-Abbau und damit die P-Verdaulichkeit aus pflanzlichen Futtermitteln. Eine vollständige Dephosphorylierung von InsP im praecaecalen Verdauungstrakt spiegelte sich in der Zunahme des finalen Abbauprodukts myo-Inositol in der Ileumdigesta, dem Urin und dem Blut der Schweine wider. Jedoch blieb am Ende des Dünndarms noch ein Teil des P in InsP gebunden, welches nicht vom Tier genutzt werden konnte. Nichtdestotrotz wurde mit einigen Rationen, die in der hier vorliegenden Arbeit getestet wurden, die empfohlene Konzentration an verdaulichem P erreicht. Dies legt nahe, dass Rationen, die mit ausreichend InsP-haltigen Futtermitteln formuliert werden und exogene Phytase enthalten, nicht mit mineralischen P-Quellen ergänzt werden brauchen. Dies vermindert die Abhängigkeit von endlichen P-Quellen in der Schweineernährung.