Lokalisation von Pheromon-Rezeptoren und -Bindeproteinen in antennalen Sensillen von Insekten

Abstract

The remarkable reactivity of moth to specific pheromones is based on the extreme selectivity and sensitivity of sensory cells in the male antennae. This feature is supposed to be based on cells equipped with specific receptors. Only the sequencing of the genomes of Bombyx mori and Heliothis virescens provided the possibility to identify candidate genes of olfactory receptors in moths. Upon detailed inspection of candidate receptors it turned out that within the generally very heterogeneous group of receptor-genes a subfamily exists containing members of both species showing striking sequence homology. A conservation of the primary structure of receptors for pheromones has been postulated. For a continuing characterization in these studies different approaches were used to verify that these receptors are indeed expressed in cells of pheromone-sensitive sensilla (sensilla trichodea). By means of ?whole mount? in situ hybridization experiments the RNA of the receptor types BmOR1 and BmOR3 could be visualized in directly neighboring cells reflecting the topology of trichoid sensilla. Also some of the Heliothis receptor types (HR13, HR14, HR16) could be assigned to sensilla trichodea. In addition to the specific receptors, the pheromone binding proteins (PBPs) are expected to play an important role in the detection of hydrophobic pheromone molecules. PBPs are produced by glia-like cells surrounding the sensory neurons. In double in situ hybridization experiments it could be shown that HR13-cells are indeed surrounded by cells expressing HvirPBP1 and HvirPBP2. Analysis comparing the topology of different receptor-types showed that cells expressing HR13 can be assigned to sensilla trichodea type A, whereas HR14 and HR16 are expressed in cells of sensilla trichodea type C. This characteristic expression pattern is considered as a further indication that these candidate-receptors are indeed pheromone-receptors. The assignment of individual receptor-types to distinct sensilla-types provides the basis for investigating the functional implications of receptor-types for the registration of main or minor components of complex pheromone-blends. Further it turned out that HR13 shows coexpression with SNMP1 (sensory neuron membrane protein 1) which is considered as a ?marker?-protein for antennal sensory neurons. This is however not the case for receptor types HR14 and HR16. In search of further SNMP-types screening-experiments were carried out which led to the identification of a novel SNMP-type (SNMP2) of Heliothis virescens. Subsequent studies concerning the expression of SNMP2 showed that the topologic distribution of SNMP2-cells is comparable to SNMP1-cells, but they show a different morphology. Further experiments revealed that SNMP2 is in fact expressed in PBP-producing cells. These findings imply that the proposed putative function of SNMPs has to be reconsidered. One major goal of this study was the attempt, to identify receptor-relevant cells by visualization of mRNA via in situ hybridization but to visualize the localization of the receptor-protein via immunohistochemical approaches. Although the generation of antibodies for olfactory receptors is very difficult, it was possible to raise antibodies specific for receptor type HR13. Using these antibodies in immunohistochemical approaches allowed to also visualize HR13-receptor-protein. By means of double-staining experiments using HR13-specific antisense RNA-probes and anti-HR13 antibodies mRNA and protein were visualized in the same specific cells. Using confocal laserscanning microscopy, it was possible to document that receptor-protein was indeed located in the sensory dendrites. Further, the receptor-protein was also visualized in the axonal processes of sensory cells and the receptor-specific staining revealed that within the antennal nerve HR13-axons appear to be organized in fascicles. These HR13-immunolabeled fascicles were visible until they reach the ?sorting zone? of the antennal lobe; in contrast to mouse olfactory bulb, no receptor specific staining was visible in the antennal lobe.

Die bemerkenswerte Reaktivität von Motten auf spezifische Pheromone basiert auf einer extrem hohen Selektivität und Sensitivität der sensorischen Zellen in den Männchenantennen. Als Grundlage dafür wird eine Ausstattung der Zellen mit spezifischen Rezeptoren angesehen. Erst die Genom-Sequenzierung von Bombyx mori und Heliothis virescens hat eine Identifizierung von Kandidaten-Genen für olfaktorische Rezeptoren ermöglicht; dabei hat sich gezeigt, dass diese generell sehr heterogene Gruppe von Rezeptorgenen eine Subfamilie umfasst, die über Speziesgrenzen hinaus eine auffällige Sequenzhomologie aufweist. Eine konservierte Primärstruktur war für Pheromonrezeptoren postuliert worden. Im Hinblick auf eine Charakterisierung wurde im Rahmen dieser Arbeit mit verschiedenen experimentellen Ansätzen geprüft, ob diese Rezeptorkandidaten in Zellen der Pheromon-sensitiven Sensillenhaare (Sensilla trichodea) exprimiert werden. Mittels ?whole mount? in situ Hybridisierung wurde in den Antennen von Bombyx mori die RNA der Rezeptortypen BmOR1 bzw. BmOR3 in Zellen visualisiert, die unmittelbar benachbart positioniert sind und in ihrem Verteilungsmuster den trichoiden Sensillenhaaren entsprechen. Entsprechend konnte auch bei Heliothis virescens für einige Rezeptortypen dieser Gruppe (HR13, HR14, HR16) gezeigt werden, dass sie in Zellen exprimiert werden, die den Pheromon-sensitiven trichoiden Sensillenhaaren zugeordnet werden konnten. Neben den spezifischen Rezeptoren der Sinneszellen wird bei der Detektion von hydrophoben Pheromonmolekülen auch den Pheromonbindeproteinen (PBPs) eine wichtige Funktion zugeschrieben; PBPs werden in Glia-ähnlichen Zellen produziert, welche die Sinneszellen umgeben. In Doppel- in situ Hybridisierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass z.B. die HR13-Zellen in der Tat von HvirPBP1- und HvirPBP2-exprimierenden Zellen umgeben sind. Vergleichende Untersuchungen zur Topologie verschiedener Rezeptortypen haben gezeigt, dass HR13-Zellen dem trichoiden Sensillen-Typ A zuzuordnen sind, während HR14 und HR16 in Zellen des Sensillen-Typs C exprimiert werden. Diese charakteristischen topologischen Expressions-muster sind als weiterer Hinweis zu werten, dass es sich bei den Rezeptorkandidaten tatsächlich um Rezeptoren für Pheromone handeln dürfte. Die Zuordnung individueller Rezeptortypen zu distinkten Sensillen-Typen eröffnet neue Ansätze für die Ermittlung der funktionellen Implikationen von Rezeptortypen für die Registrierung von Haupt- und Nebenkomponenten komplexer Pheromon-Gemische. Im Verlauf einer weiteren Charakterisierung von Rezeptor-exprimierenden Zellen hat sich gezeigt, dass nur der Rezeptortyp HR13 eine Coexpression mit einem ?Markerprotein? für sensorische Neurone, dem SNMP1 (Sensory Neuron Membrane Protein 1) aufwies, nicht jedoch die beiden Rezeptortypen HR14 und HR16. Zur Überprüfung der These ob u. U. ein weiterer SNMP-Subtyp existiert, wurden Screeningverfahren durchgeführt und dabei tatsächlich ein neuer SNMP-Typ (SNMP2) von Heliothis virescens identifiziert. Untersuchungen zur Expression haben gezeigt, dass die topologische Verteilung der SNMP2-Zellen zwar mit der von SNMP1-Zellen vergleichbar ist, dass sie jedoch eine sehr unterschiedliche Morphologie aufweisen. Weiterführende Untersuchungen haben dann gezeigt, dass SNMP2 in den PBP-produzierenden Hüllzellen der trichoiden Sensillenhaare exprimiert wird. Diese Befunde stellen die SNMP-Proteine in einen neuen Kontext und eröffnen neue Spekulationen über deren mögliche Funktionen. Ein wichtiges Ziel dieser Arbeit war der Versuch, die Rezeptor-relevanten Zellen nicht nur mittels mRNA-Visualisierung zu identifizieren, sondern die eigentlichen Rezeptorproteine immunhistochemisch zu erfassen. Obwohl sich die Generierung von Antikörpern für olfaktorische Rezeptoren als extrem schwierig erwiesen hat, ist es gelungen, für den Rezeptortyp HR13-spezifische Antikörper zu gewinnen. Mit Hilfe dieser Antikörper war es dann erstmals möglich, immunhistochemische Untersuchungen zur Lokalisation des Rezeptorproteins HR13 durchzuführen. In Doppelmarkierungsstudien mit einer HR13 antisense RNA-Sonde und den HR13-spezifischen Antikörpern konnte die Colokalisation von mRNA und Protein in den entsprechenden Zellen nachgewiesen werden. Darüber hinaus war es mit konfokaler Laserscanningmikroskopie möglich, die Verteilung des Rezeptorproteins in den verschiedenen Kompartimenten, insbesondere auch in den sensorischen Dendriten, zu visualisieren. Außerdem hat sich gezeigt, dass Rezeptorproteine auch in den axonalen Fortsätzen der sensorischen Zellen vorkommen. Durch Rezeptor-spezifische Markierungen wurde deutlich, dass die Axone mit HR13-Rezeptoren im antennalen Nerv als Bündel organisiert sind. Im Antennen-Nerv konnten HR13-markierte Axone bis zum Eintritt in die ?sorting zone? des antennalen Lobus visualisiert werden; im Unterschied zu den Befunden bei der Maus, war eine Markierung in den entsprechenden Glomeruli nicht nachweisbar.