Variabilität und Induzierbarkeit von Cytochrom P450 Monooxygenasen in humanen Leberproben und Hepatozyten : Untersuchungen mittels LC-MS/MS Cocktail-Assay und RNA-Interferenz

Abstract

The variability of the expression and function of the P450 enzymes (CYPs) is a cause for having different intensities and lengths of effects as well as side effects when patients are given the same dosage of medication. Up to this day, one cannot allover explain this inter individual variability of expression and activity of the enzymes. In general, there are several factors that may affect the variability, including biological factors (such us age, gender, hormonal status), environmental factors (such as nutrition, smoking, medication) as well as genetic factors like polymorphisms In order to solve this problem and to analyze relatively easy and fast activity differences, we developed an LC-MS/MS based P450 activity cocktail assay to quantify and detect simultaneously the seven most important CYPs as judged by their roles in the metabolism of clinically used drugs. The assay was established for use in in human hepatocytes as well as in recombinant and microsomal enzymes. We used the newly developed model-substrate cocktail assay to analyze the time-dependent induction of seven drug metabolizing cytochrome P450 activities as response to treatment of primary human hepatocytes with different statins. The strongest induction was observed for amodiaquine N-desalkylation of CYP2C8, which was induced up to 20-fold by atorvastatin and approximately 10-fold by simvastatin and lovastatin. Enzymes CYP3A4, CYP2B6 and 2C9 showed lower, but also significant induction after treatment with atorvastatin and simvastatin (4-11-fold). lovastatin and rosuvastatin demonstrated minor effects. Quantitative RT-PCR confirmed corresponding changes on the mRNA level with even more dramatic induction up to almost 100-fold. These data suggest a broader inducing effect of statins on cytochrome P450 expression and activity than previously known, thus further emphasizing their drug-drug interaction potential, especially for CYP2C8. Based on correlation analysis with P450 enzyme activity to their specific protein amount in human liver samples (liverbank IKP) were different functional results observed. Enzymes like CYP3A4 with atorvastatin hydroxylation or CYP1A2 with formation of acetaminophen showed very good correlations. Others like i.e. CYP2C9 with specific substrate diclofenac correlated much lower. Besides biological and environmental factors could these differences based on variability of the enzymes NADPH:P450 oxidoreductase (POR), cytochrome b5 or the two progesterone receptor-membrane components PGRMC1 and PGRMC2. After all, they would take active part in the metabolism of the xenobiotica as possible electron donors of the CYP enzymes. In order to analyze what kind of influence these proteins have on CYP enzyme activity, we developed a lentiviral based RNA-interference (RNAi) method in human hepatocytes and determined P450 activity with cocktail-assay after knocking down these genes. For the P450 reductase, we achieved a successful gene silencing of about 85% on mRNA level. The expression of cytochrome b5 was reduced by 51%, PGRMC1 about 30%. So far, it has not been possible to prove a significant knock down of PGRMC2. After silencing of reductase, an average light decline of about 10-30% of P450 enzyme activities was observed after 4 days. After a period of 7 days, a rest activity of CYP3A4 of only about 5% was detected. For both other potential electron donators cytochrome b5 and PGRMC1 was a reduced activity of 85% and 75% determined. These first results indicate a clear interaction of the enzymes POR, cytochrome b5 and PGRMC1 with the drug metabolizing enzymes.

Die Variabilität der Expression und Funktion der P450 Enzyme (CYPs) ist eine der Ursachen dafür, dass bei gleicher Dosierung eines Medikaments Intensität und Dauer von Wirkungen und Nebenwirkungen von Patient zu Patient unterschiedlich sein können. Diese interindividuelle Variabilität der Enzyme lässt sich heute noch nicht lückenlos erklären. Prinzipiell können biologische Faktoren (z.B. Alter, Geschlecht, Hormonstatus), Umweltfaktoren (Ernährung, Rauchen, Arzneimittelinteraktionen) sowie genetische Faktoren, z.B. Polymorphismen, Enzymfunktionen beeinflussen. Um dieser Problematik nachgehen zu können und auf Aktivitätsebene relativ schnell und einfach Unterschiede nachzuweisen, wurde ein LC-MS/MS basierter P450 Cocktail-Assay zur Quantifizierung der sieben wichtigsten Enzymaktivitäten für den Arzneistoffwechsel entwickelt und in humanen Hepatozyten etabliert. Am Beispiel der Arzneistoffgruppe der HMG-CoA Reduktasehemmer (Statine) wurden Untersuchungen der Cytochrom P450 Enzyme durch zeitabhängige Enzyminduktionsprofile mittels Cocktail-Assay und mRNA-Expression gemessen. Das CYP2C8 wurde als neues, von Statinen stark induziertes P450 Enzym identifiziert. Es wurde eine bis zu 20-fache Zunahme der Aktivität durch Atorvastatin und eine ~10-fache Zunahme durch Simvastatin- und Lovastatinbehandlung nachgewiesen. Die Enzyme CYP3A4, CYP2B6 und CYP2C9 zeigten geringere, aber auch deutliche Aktivitätssteigerungen durch die Behandlung mit Atorvastatin und Simvastatin (4 bis 11-fach). Lovastatin und Rosuvastatin hatten geringere Effekte. Die Expression der mRNA entsprach weitestgehend den Beobachtungen der Aktivitäten, wobei jedoch die Auswirkungen dynamischer und drastischer mit wesentlich höheren Induktionsleveln ausfielen. Die Ergebnisse deuten auf einen stärkeren Einfluss der Behandlung mit Statinen auf P450 Expression und Aktivität hin, als bisher angenommen. Dies könnte besonders für die Co-Medikation mit anderen über CYP2C8 metabolisierten Arzneistoffen von entscheidender Bedeutung sein. Aufgrund von Korrelationsanalysen der P450 Enzymaktivitäten zu ihrem spezifischen Proteingehalt in humanen Leberproben (Leberbank am IKP) wurden unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der Funktion einzelner CYP-Enzyme beobachtet. Manche CYP-Enzyme, wie z.B. CYP3A4 mit der Hydroxylierung von Atorvastatin oder CYP1A2 mit der Bildung von Acetaminophen zeigten sehr gute Korrelationen. Andere Enzyme wie z.B. CYP2C9 mit dem spezifischen Substrat Diclofenac, korrelierten wesentlich schlechter. Diese Unterschiede könnten neben biologischen Faktoren und Umwelteinflüssen mit Variabilität in den Enzymen NADPH:P450 Oxidoreduktase (POR), Cytochrom b5 oder den beiden Progesteronrezeptor-Membrankomponenten PGRMC1 und PGRMC2 zusammenhängen. Denn als potentielle Elektronendonatoren der CYP-Enzyme wären diese maßgeblich am Metabolismus von Xenobiotika beteiligt. Zur Untersuchung, welchen Einfluss die Elektronendonator-Proteine auf die Aktivität der CYP-Enzyme haben, wurde die Technik einer lentiviral basierten RNA-Interferenz (RNAi) für diese Gene in primären humanen Hepatozyten entwickelt und die P450 Aktivitäten mittels Cocktail-Assay nach dem »Knock-Down« dieser Gene bestimmt. Für die P450 Reduktase wurde ein erfolgreiches »Gene Silencing« von durchschnittlich 85% auf mRNA-Ebene erzielt. Die Expression von Cytochrom b5 wurde um 51% reduziert, PGRMC1 um ca. 30%. Für PGRMC2 konnte bisher kein signifikanter »Knock-Down« nachgewiesen werden. Nach dem »Silencing« der Reduktase wurde für die P450 Enzymaktivitäten nach 4 Tagen durchschnittlich ein leichter Rückgang von ca. 10-30% beobachtet. Nach einer Zeitdauer von 7 Tagen wurde für das CYP3A4 im Vergleich zur Kontrolle nur noch eine Restaktivität von ungefähr 5% detektiert. Für die beiden anderen potentiellen Elektronendonatoren Cytochrom b5 und PGRMC1 wurde entsprechend eine um 85% bzw. 75% reduzierte CYP3A4 Aktivität nachgewiesen. Diese ersten Ergebnisse sprechen deutlich für eine Interaktion der Enzyme POR, Cytochrom b5 und PGRMC1 mit den Arzneistoff metabolisierenden P450 Enzymen.