Interaktion des bakteriellen Quorum Sensing Moleküls N-(3-oxododecanoyl)-L-Homoserin-Lacton (AHL-12) mit humanen neutrophilen Granulozyten

Abstract

To evade immune-defense mechanisms of the host, Pseudomonas aeruginosa form so called biofilms. To coordinate this complex process, the bacteria communicate via quorum sensing signals, such as N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (AHL-12). AHL-12 is also recognized by human polymorphonuclear neutrophils (PMN). It is chemotactic for PMN and thus might cause their directed migration to the site of infection in order to eliminate infiltrated microorganisms. Through different approaches, the aim of this work was to find out in which way AHL-12 interacts with PMN. As a first step, an AHL-12 induced signaling-pathway should be elucidated in in vitro experiments using primary, human PMN. In a further approach using radioactive- (3H-AHL-12) and fluorescence-labeled (AHL-12-FITC) AHL-molecules, the interaction of AHL-12 with PMN should be examined, especially with regard to the expression of a specific receptor for AHL-12 on PMN. In this work it was confirmed that AHL-12 induced chemotaxis of human PMN. After stimulation of PMN with AHL-12, MAPK-p38 was phosphorylated and hence activated. Furthermore, it was shown that MAPK-p38 phosphorylated MAPKAP-Kinase 2, which in turn phosphorylated and hence activated leukocyte specific protein 1 (LSP1). LSP1 finally affected chemotaxis via binding to F-Actin and by modulating the intensity of integrin-mediated adherence. The AHL-12 induced chemotaxis was inhibited by SB203580, an inhibitor of MAPK-p38. The question, whether there is a specific receptor for AHL-12 in PMN, could not be answered conclusively, because it was not possible to isolate a protein with receptor function using conventional methods such as immunoprecipitation and crosslinking. In uptake studies with 3H-AHL-12 and AHL-12-FITC, it was shown, that the major portion of AHL-12-FITC bound to the cell membrane. However, another portion got into the cells, which raises the possibility that an intracellular receptor or an intracellular binding protein for AHL-12, for example IQGAP1, exists. Taken together these data provide evidence that AHL-12 is chemotactic for PMN. Assuming that AHL-12 is released in the early phase of biofilm formation, before bacteria are embedded in the EPS, PMN have the chance to kill bacteria and thus could contribute to prevent biofilm formation.

Um der Immunantwort ihres Wirtes zu entgehen, bilden Pseudomonas aeruginosa sogenannte Biofilme. Während dieses komplexen Vorganges dient ihnen das Quorum Sensing Signalmolekül N-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserin Lacton (AHL-12) zur Kommunikation untereinander. AHL-12 wird jedoch auch von humanen, polymorphkernigen, neutrophilen Granulozyten (PMN) erkannt. Es ist chemotaktisch für PMN und könnte so die Einwanderung der Zellen an den Ort der Infektion bewirken, um dort eingedrungene Mikroorganismen zu bekämpfen. Ziel dieser Arbeit war es, über verschiedene Ansätze herauszufinden, wie AHL-12 mit neutrophilen Granulozyten interagiert. Dazu sollte in in vitro Experimenten mit primären, humanen PMN zunächst ein AHL-12-induzierter Signalweg bestimmt werden. In einem weiteren Ansatz sollte mithilfe radioaktiv- (3H-AHL-12) und fluoreszenzmarkierter (AHL-12-FITC) AHL-Moleküle untersucht werden, ob AHL-12 an PMN bindet, oder passiv in die Zelle gelangt und ob humane neutrophile Granulozyten einen spezifischen Oberflächenrezeptor für AHL-12 exprimieren. In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass AHL-12 in PMN Chemotaxis induzierte und es konnte gezeigt werden, dass nach Stimulation der PMN mit AHL-12, MAPK-p38 phosphoryliert und somit aktiviert wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass MAPK-p38 die MAPKAP-Kinase 2 (MK2) phosphorylierte, welche dann wiederum das Leukozytenspezifische Protein 1 (LSP1) phosphorylierte und somit aktivierte. Phospho-LSP1 vermittelte letztlich die AHL-12 induzierte Chemotaxis durch Interaktion mit F-Aktin, sowie über Modulation der Integrin-vermittelten Adhärenz. Durch den MAPK-p38 Inhibitor SB203580 konnte die AHL-12 induzierte Chemotaxis inhibiert werden. Die Frage, ob ein spezifischer eukaryotischer Rezeptor für AHL-12 existiert, konnte nicht abschließend beantwortet werden, da es nicht gelungen war, mit üblichen Methoden, wie Immunpräzipitation und Crosslinking, ein Protein mit Rezeptorfunktion zu isolieren. Die Bindungsstudien mit 3H-AHL-12 und AHL-12-FITC zeigten, dass ein Großteil des AHL-12-FITC an die Zellmembran gebunden hatte, während ein Teil des AHL in die Zellen gelangt war, sodass auch ein intrazellulärer Rezeptor, oder ein intrazelluläres Bindungsprotein wie IQGAP1 mögliche Interaktionspartner für AHL-12 darstellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass AHL-12 für PMN chemotaktisch ist. Unter der Annahme, dass AHL-12 in einer frühen Phase der Biofilmbildung freigesetzt wird, bevor Bakterien durch die EPS geschützt sind, haben PMN die Chance Bakterien abzutöten und können so dazu beitragen, die Biofilmbildung zu verhindern.