Regulation of phosphate deficiency-induced carboxylate exudation in cluster roots of white lupin (Lupinus albus L.)

Abstract

In many tropical and subtropical areas crop production is severely limited by a deficiency of plant-available phosphorus (P) in the soils. Therefore plant mechanisms to mobilize the sparingly soluble P fraction are of high interest. One such mechanism of P-deficient plants is the exudation of carboxylates and protons from roots. White lupin (Lupinus albus L.) was chosen as a model system to investigate plant metabolism under P deficiency which enable the plant to release ex-traordinarily high amounts of citrate and protons from its cluster roots (bottlebrush-like clusters of short rootlets of determinate growth which form along secondary lateral roots). The aim of this work was to determine the reasons for the high citrate acccumulation observed in mature cluster roots of P-deficient white lupin and to characterize the regulation of citrate release. A threshold citrate concentration is seen as a prerequisite for the transient pulse of intense citrate exudation associated with rhizosphere acidification which occurs over a time period of 2-3 days. Biochemical changes on the anabolic side of citrate metabolism such as increased activities of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEP-C) or malate dehydrogenase (MDH) cannot solely ex-plain the very high citrate accumulation observed during cluster root development, although these reactions supply the cluster roots with citrate precursors. In addition, pyruvate concentra-tions decrease in developing cluster roots, probably in relation to the decreasing malic enzyme activities in the respective clusters. Citrate accumulation might also be caused by an impaired citrate turnover. Aconitase, the en-zyme catalyzing the turnover of citrate via cis-aconitate to isocitrate, showed decreasing activi-ties during cluster root development. NADP-isocitrate dehydroganase (NADP-ICDH) activities, as the next metabolic reaction which oxidizes isocitrate to 2-oxoglutarate, paralleled aconitase activities in all the different root segments investigated, although on a two- to threefold higher level. For this, aconitase rather than NADP-ICDH activities seem to limit citrate turnover. Spe-cific activities of aconitase and NADP-ICDH were the same in all the root segments investi-gated. Aconitase is rapidly inactivated by H₂O₂, which can be produced at increased rates under P limitation. However, neither H₂O₂ concentrations nor malondialdehyde concentrations as a marker for lipid peroxidation under oxidative stress were increased in clusters with low aconitase activities. Artifical inhibition of aconitase by incubating young cluster roots with high amounts of externally applied H₂O₂ did not change citrate and malate concentrations in these root seg-ments. However, a strong increase in citrate concentrations and a strong decrease in malate con-centrations in young cluster roots, together with high citrate exudation rates, could be observed when monofluoroacetate (MFA) as another aconitase inhibitor was applied. Inhibition of the aconitase enzyme therefore forced still young clusters to react like mature ones. This hints to aconitase as a key metabolic step in citrate turnover. High rates of carboxylate exudation were measured even from seedling root tips when incubated with MFA. Decreasing dehydrogenase activities as found during cluster root development by in situ staining with formazan were independent of the substrate supplied (citrate, aconitate, isocitrate, succinate, malate). This is in accordance with the decreasing enzyme activities measured in the different root segments such as aconitase, NADP-ICDH or malic enzyme in vitro. A reduced nitrate re-ductase (NR) activity under P deficiency, resulting in a lower drainoff of 2-oxoglutarate for N assimilation, seems not to play an important role for citrate accumulation, since an artificial NR inhibition with tungstate did not significantly increase citrate concentrations in young cluster roots. The change from malate to citrate accumulation during cluster root development is paralleled by a reduction in ATP-citrate lyase (ACL) activity, an enzyme cleaving citrate to oxaloacetate and acetyl-CoA. The good correlation between the citrate/malate ratio in root exudates and ACL ac-tivities indicates that ACL plays a key role as a metabolic switch between malate and citrate ac-cumulation during cluster root development under P deficiency. The enzyme might prevent high citrate concentrations under less severe P deficiency, when ACL activity is not limited by ATP availability. The attempt to inhibit the ACL enzyme by application of hydroxycitrate (HC) did not show any effect on citrate or malate concentrations in the young cluster roots. However, HC was probably not taken up into the root cells and could therefore not exert any inhibitory effects. Decreasing total respiration rates as found for developing cluster roots might affect citrate accu-mulation directly by reduced consumption of citrate in the TCA cycle or indirectly by H₂O₂-induced inhibition of aconitase activity. However, a reduced respiration rate did not result in higher H₂O₂ concentrations in white lupin. Cytochrome pathway capacity decreased parallel to total respiration, suggesting that the cytochrome pathway determines total respiration. An in-crease in alternative oxidase (AOX) capacity did take place in cluster roots, but was not high enough to compensate for the decreased cytochrome capacity. The AOX enzyme often occurs under P deficiency or under oxidative stress, probably to bypass a limiting Pi-and ADP-dependent cytochrome pathway. The amount of the AOX protein, determined by immunodetec-tion, paralleled AOX capacity. However, the availability of Pi and adenylates was not limiting for total respiration, since uncoupling oxidative phosphorylation with CCCP did not increase the respiration rate. The citrate/malate ratio in young clusters with high rates of respiration and low inherent levels of citrate accumulation was only slightly increased by short-term application (4 -8 h) of azide and SHAM as respiration inhibitors.

The concomitant release of citrate and protons from mature cluster roots of P-deficient white lupin plants hints to a common regulation of citrate exudation and H+-ATPase activity in this specific root zone. Highly purified inside-out plasma membrane (PM) vesicles were isolated in a membrane-physiological approach to determine H+-ATPase characteristics involved in citrate exudation under P deficiency. Increased hydrolytic activity of the PM H+-ATPase derived from P-deficient plants parallels an increase in rhizosphere acidification and citrate exudation and hints to a causal relationship. Western blot analysis revealed a higher H+-ATPase protein amount under P deficiency. The op-timum pH of the H+-ATPase was shifted towards more acidic conditions under P-deficiency, which might be an adaptation to the supposedly decreased cytosolic pH brought about by the pH stat mechanism when carboxylates accumulate. Lower citrate concentrations (2 mM) stimulated PM vesicle acidification even in the absence of ATP, which was further enhanced by the addi-tion of Mg-ATP, and particularly expressed in PM vesicles isolated from roots of P-deficient plants. Accordingly, 14C-citrate was taken up at higher rates into vesicles derived from P-deficient white lupin compared with vesicles of P-sufficient control plants. Therefore citrate transport predominantly occurs in roots of P-deficient plants, and is linked with the activity of the PM H+-ATPase to maintain the electrochemical potential gradient which is reduced by citrate export out of the cell. Citrate exudation combined with an increase in H+-ATPase activity seems to prevent citrate accumulation up to concentrations which might exert inhibitory effects on the PM H+-ATPase. Such an inhibition was seen by diminished intravesicular proton accumulation, detected with the pH probe acridine orange, when 5 mM citrate were applied to the vesicle preparation. No such inhibitory effects were observed by malate application, which hints to a citrate-specific reaction. Lowering the cytosolic pH by external application of propionate stimulated citrate and malate exudation in non-cluster laterals and in young clusters. Therefore a causal relationship might exist between citrate accumulation and exudation by acidification of the cytosol. The threshold citrate concentration at which citrate exudation is triggered perhaps is reached when citrate ac-cumulation leads to acidification of the cytosol. Carboxylate exudation in young cluster roots and seedling root tips hints to a putative anion channel which already exists in young tissue and might be regulated in relation with H+-ATPase activity and cytosolic pH. Protoplasts, isolated from mature cluster roots, did only give very low yield and were not viable for seals high enough for patch-clamp studies. This might be due to the fast senescence in the developing clusters which also seems to change membrane integrity. High yields could only be gained from seedling root tips, or cotyledons. Similarly, protoplast isolation from root hairs also was only possible from seedling root tips or non-cluster lateral root tips, but even not from just emerging root hairs of young cluster roots.

To determine the influence of a second growth factor in addition to P deficiency on citrate me-tabolism, white lupin was cultivated in nutrient solution and in rhizoboxes at ambient (400 μmol mol-1) and at elevated (800 μmol mol-1) atmospheric CO₂ concentrations. Plant development was accelerated at elevated CO₂ concentrations, and P deficiency and senes-cence symptoms such as yellowing, wilting, and abscission of leaves could be seen much earlier. When cultivated in nutrient solution, shoot growth was rather unaffected by the CO₂ concentra-tion, whereas root growth was much faster at elevated CO₂. Quite contrary, shoot growth was slightly higher at elevated CO₂ concentrations in plants in rhizobox culture, but root growth was unchanged. However, the harvest of a higher amount of cluster roots from plants at elevated CO₂ or the calcareous soil might have reduced root growth of the plants grown in rhizoboxes. Higher root/shoot ratios under P deficiency were further increased at elevated CO₂ concentra-tions. The amount of clusters was higher in plants grown in nutrient solution at 800 μmol mol-1 CO₂ from day 21 to day 33 after sowing, but thereafter the differences disappeared. No signifi-cant differences between CO₂ treatments were observed for the proportion of cluster roots rela-tive to the whole root system. Independent of the cultivation method, root exudation per cluster or per cluster root weight was unchanged by the elevated CO₂ concentration. The distribution of citrate and malate exudation in different cluster root segments with decreasing malate exudation and a peak of citrate exudation in mature clusters was also confirmed at 800 μmol mol-1 CO₂. The increased carbon distribution into the root at 800 μmol mol-1 CO₂, seen in a higher root/shoot ratio, was not transformed into higher exudation rates from the single cluster. Acid and alkaline phosphatase activities in the rhizosphere of L. albus continually increased during cluster root development independent of the CO₂ supply. Phosphatase activities and carboxylate accumulation and exudation rates were essentially un-changed by different atmospheric CO₂ concentrations. This might be due to also unaltered Pi concentrations in the respective root segments, because internal P concentrations seem to deter-mine these parameters. Since citrate accumulation and exudation probably depends on citrate degradation, which is not influenced by the amount of carbon supplied for anabolic processes, elevated CO₂ concentrations do rather not change citrate concentration and exudation. Accord-ingly, no significant effects of different CO₂ concentrations were seen on microbial diversity in the rhizosphere of white lupin. So far, no single cause or mechanism was found to be responsible for the high citrate concentra-tions measured in mature cluster roots, although citrate degradation seems to be important and aconitase probably plays a key role. A general impairment of metabolism due to decreasing con-centrations of Pi, adenylates, RNA, and proteins rather seems to bring about decreasing enzyme activities and reduced respiration. Various regulatory mechanisms via phosphorylation/ dephos-phorylation, phytohormones, nitric oxide, or others also have to be considered.

In vielen tropischen und subtropischen Gebieten wird die Produktion landwirtschaftlicher Er-zeugnisse durch einen Mangel an pflanzenverfügbarem Phosphat (P) limitiert. Deshalb sind Me-chanismen von Pflanzen, die schwer lösliche P-Fraktionen mobilisieren, von hohem Interesse. Einer dieser Mechanismen unter P-Mangel besteht aus der Mobilisation schwer verfügbaren Phosphats durch die Wurzelexsudation von Carboxylaten und Protonen. An Weisslupine (Lupinus albus L.) als Modellpflanze sollte der Stoffwechsel unter P-Mangel untersucht werden, der die Pflanze in die Lage versetzt, extrem hohe Mengen an Citrat und Pro-tonen von ihren Clusterwurzeln (flaschenbürstenartige Bündel kurzer Seitenwurzeln mit be-grenztem Längenwachstum, die an Lateralwurzeln zweiter Ordnung gebildet werden) abzuge-ben. Das Ziel der Arbeit war es, die Ursachen der hohen Citratakkumulation zu ermitteln, wie sie in den reifen Clusterwurzeln der Weisslupine unter P-Mangel gefunden wird. Ebenso sollte die Regulation der Citratabgabe charakterisiert werden. Das Erreichen eines Citrat-Schwellenwertes wird als Voraussetzung für den vorübergehenden, zwei bis drei Tage andauernden Puls einer intensiven Citratabgabe gesehen, die mit einer An-säuerung der Rhizosphäre einhergeht. Die Stoffwechselveränderungen auf der anabolen Seite des Citratstoffwechsels, wie die erhöhten Aktivitäten der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase oder der Malat-Dehydrogenase, können die Verschiebung von einer Malatanreicherung zu der sehr hohen Citratanreicherung, wie sie während der Clusterwurzelentwicklung beobachtet wird, nicht voll-ständig erklären, obwohl die Clusterwurzeln dadurch mit Vorläufersubstanzen des Citrats ver-sorgt werden. Zusätzlich nimmt die Pyruvatkonzentration in den sich entwickelnden Clusterwur-zeln ab, was wahrscheinlich in Zusammenhang mit der nachlassenden Aktivität des Malat-Enzyms in den entsprechenden Clustern zu sehen ist. Die Citratanreicherung könnte auch durch einen gestörten Citratumsatz hervorgerufen sein. Das Enzym Aconitase, das den Umsatz von Citrat über cis-Aconitat zu Isocitrat katalysiert, zeigte in den sich entwickelnden Clusterwurzeln nachlassende Aktivität. Die Aktivität der NADP-Isocitrat-Dehydrogenase (NADP-ICDH), die als nachfolgenden Stoffwechselschritt den Umsatz des Isocitrats zu 2-Oxoglutarat katalysiert, nahm parallel zu der Aktivität der Aconitase in allen untersuchten Wurzelabschnitten ab, in den entsprechenden Wurzelabschnitten jedoch mit einer jeweils zwei-bis dreifachen höheren Aktivität. Deshalb limitiert wahrscheinlich eher die Aconi-tase als die NADP-ICDH den Citratumsatz. Die spezifischen Aktivitäten der Aconitase und der NADP-ICDH waren jedoch in allen untersuchten Wurzelabschnitten jeweils gleich. Die Aconitase wird durch H₂O₂, welches bei P-Mangel mit erhöhter Rate produziert werden kann, schnell inaktiviert. Es waren jedoch weder die Konzentrationen an H₂O₂ noch die des Malondialdehyds als Markersubstanz für Lipidperoxidation unter oxidativem Stress in den Clu-sterwurzeln erhöht, die geringe Aconitaseaktivität zeigten. Eine künstliche Hemmung der Aconitase durch eine Inkubation der noch jungen Clusterwurzeln mit hohen H₂O₂-Konzentrationen veränderte die Citrat- und Malatkonzentrationen jedoch nicht. Ein starker Anstieg der Citratkonzentration und eine starke Abnahme der Malatkonzentration, in Kombination mit hohen Citratabgaberaten, konnte jedoch in jungen Clusterwurzeln beobachtet werden, die mit dem Aconitasehemmstoff Monofluoracetat (MFA) behandelt wurden. Die Hemmung der Aconitase zwang damit die noch jungen Clusterwurzeln, wie reife Clusterwurzeln zu reagieren. Das deutet auf die Aconitaseaktivität als eine Schlüsselreaktion beim Citratumsatz hin. Hohe Abgaberaten an Carboxylaten wurden sogar in Wurzelspitzen von Keimlingen nach MFA-Inkubation beobachtet. Nachlassende Aktivitäten von Dehydrogenasen, wie sie während der Clusterwurzelentwicklung durch in situ-Färbung mit Formazan festgestellt wurden, waren unabhängig vom angebotenen Substrat (Citrat, cis-Aconitat, Isocitrat, Succinat, Malat). Das stimmt mit den nachlassenden En-zymaktivitäten wie der Aconitase oder der NADP-ICDH in den verschiedenen Wurzelabschnit-ten überein, wie sie in vitro gemessen wurden. Eine nachlassende Nitratreductase (NR)- Aktivi-tät unter P-Mangelbedingungen, die zu einem geringeren Verbrauch von 2-Oxoglutarat für die N-Assimilation führt, scheint jedoch keine wichtige Rolle für die Citratakkumulation zu spielen, da eine künstliche Hemmung der NR mit Wolframat keinen signifikanten Anstieg der Citratkon-zentrationen in jungen Clusterwurzeln bewirkte. Der Wechsel von einer Malat- zu einer Citratakkumulation während der Clusterwurzelentwick-lung verläuft parallel zu einer nachlassenden Aktivität der ATP-Citrat Lyase (ACL), einem Enzym, das Citrat zu Oxalacetat und Acetyl-CoA spaltet. Die gute Korrelation zwischen dem Citrat/Malat-Verhältnis in den Wurzelexsudaten und der ACL-Aktivität weist darauf hin, dass ACL bei dem Wechsel von der Malat- zur Citratakkumulation in den sich entwickelnden Clu-sterwurzeln unter P-Mangel eine Schlüsselrolle spielt. Das Enzym verhindert eventuell die An-reicherung hoher Citratmengen bei mäßigem P-Mangel, solange die Aktivität der ACL noch nicht durch eine limitierte ATP-Verfügbarkeit eingeschränkt ist. Der Versuch, die ACL durch die Anwendung von Hydroxycitrat (HC) zu hemmen, zeigte keinen Einfluss auf die Citrat- und Malatkonzentrationen in den jungen Clusterwurzeln. Das HC wurde jedoch wahrscheinlich gar nicht in die Wurzelzellen aufgenommen und konnte deshalb keine hemmende Wirkung entfalten. Nachlassende Gesamtrespirationsraten, wie sie in den sich entwickelnden Clusterwurzeln gefun-den wurden, könnten eine Citratakkumulation auslösen, entweder über einen nachlassenden Ver-brauch von Citrat im Citratzyklus, oder indirekt über eine H₂O₂-induzierte Hemmung der Aco-nitaseaktivität. Nachlassende Gesamtrespirationsraten führten bei Weisslupine jedoch nicht zu einer erhöhten H₂O₂-Konzentration. Die Kapazität der cytochromabhängigen Atmungskette nahm parallel zur nachlassenden Gesamtrespirationsrate ab, was darauf hindeutet, dass diese die Gesamtrespirationsrate bestimmt. Eine Zunahme der Kapazität der Alternativen Oxidase (AOX) wurde zwar in den Clusterwurzeln gefunden, war aber nicht hoch genug, um den Verlust der Kapazität der cytochromabhängigen Atmungskette zu kompensieren. Der alternative Atmungs-weg des Enzyms AOX tritt oft unter P-Mangel oder oxidativem Stress auf, wahrscheinlich um die gehemmte, auf Pi- und ADP angewiesene cytochromabhängige Atmungskette zu umgehen. Der durch Immunodetektion ermittelte Gehalt an AOX-Protein verlief parallel zur AOX-Kapazität. Die Verfügbarkeit von Pi oder Adenylaten limitierte die Gesamtrespiration jedoch nicht, da eine Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung mit CCCP die Respirationsrate nicht erhöhte. Das Citrat/Malat-Verhältnis in jungen Clusterwurzeln mit hohen Respirationsraten und ursprünglich geringer Citratakkumulation erhöhte sich durch die Kurzzeit-Applikation (4-8 h) von Azid oder SHAM als Atmungsinhibitoren nur geringfügig.

Die gleichzeitige Abgabe von Citrat und Protonen von reifen Clusterwurzeln der Weisslupine unter P-Mangel weist auf eine gemeinsame Regulation der Citratabgabe und der H+-ATPase-Aktivität hin. Hochreine Plasmamembran (PM)-Vesikel mit inside-out-Orientierung wurden in einem membranphysiologischen Ansatz isoliert, um die Eigenschaften der H+-ATPase und ihren Zusammenhang mit der Citratexsudation unter P-Mangel zu untersuchen. Der Anstieg der hydrolytischen Aktivität der PM H+-ATPase von P-Mangelpflanzen verlief par-allel zu einer verstärkten Ansäuerung der Rhizosphäre und der Citratabgabe, was auf eine ge-meinsame Ursache hinweist. Eine Western-Blot-Analyse zeigte eine höhere Menge an H+-ATPase-Protein in Proben, die von P-Mangelpflanzen stammten. Das pH-Optimum der H+-ATPase war unter P-Mangelbedingungen zu einem saureren pH-Wert verschoben, was eine An-passung an einen vermutlich verringerten cytosolischen pH-Wert sein könnte, hervorgerufen durch den pH-Stat-Mechanismus, wenn verstärkt organische Säuren unter P-Mangel gebildet werden. Geringere Citratkonzentrationen (2 mM) stimulierten eine Ansäuerung der PM-Vesikel sogar in Abwesenheit von ATP. Bei Zugabe von Mg-ATP verstärkte sich die Ansäuerung, dabei besonders stark in PM-Vesikeln, die von P-Mangelpflanzen isoliert worden waren. Entsprechend wurde 14C-markiertes Citrat mit einer höheren Rate in die Vesikel aufgenommen, die von P-Mangelpflanzen stammten. Daraus kann geschlossen werden, dass Citrattransport hauptsächlich in den Wurzeln von P-Mangelpflanzen stattfindet und mit der Aktivität der PM H+-ATPase ge-koppelt ist, die den elektrochemischen Potentialgradienten aufrechterhält, der vom Citratexport aus der Zelle heraus verringert wird. Citratexsudation in Kombination mit einer erhöhten H+-ATPase-Aktivität, wie sie an isolierten PM-Vesikeln durch eine erhöhte hydrolytische und Pro-tonentransportaktivität bei Angebot von relativ geringen Citratkonzentrationen gemessen werden konnte, scheint eine Citratakkumulation auf Konzentrationen zu verhindern, die die H+-ATPase hemmen könnten. Solch eine Hemmung der H+-ATPase wurde durch eine geringere intravesi-kuläre Protonenanreicherung, detektiert mit der pH-Sonde Acridin Orange, bei einer Applikation von 5 mM Citrat festgestellt. Bei der Applikation von Malat traten keine hemmenden Effekte auf, was auf eine citratspezifische Reaktion schließen lässt. Eine Absenkung des cytosolischen pH-Werts durch die Applikation von Propionat stimulierte die Citrat- und Malatexsudation von clusterlosen Seitenwurzeln und von jungen Clustern. Der Schwellenwert der Citratkonzentration, ab dem die Citratexsudation ausgelöst wird, ist eventuell dann erreicht, wenn die Citratanreicherung zu einer Ansäuerung des Cytosols führt. Die Abgabe von Carboxylaten aus jungen Clusterwurzeln und aus Wurzelspitzen von Keimlingen weist auf einen vermuteten Anionenkanal hin, der bereits in jungem Gewebe existiert und eventuell in Zusammenhang mit der Aktivität der H+-ATPase und dem cytosolischen pH-Wert reguliert wird.

Aus reifen Clusterwurzeln isolierte Protoplasten erreichten nur eine sehr geringe Ausbeute und waren nicht dicht genug für die angestrebten Patch-Clamp-Untersuchungen. Das mag an der schnellen Seneszenz der sich entwickelnden Cluster liegen, die ebenfalls die Membranstabilität zu verändern scheint. Hohe Ausbeuten ließen sich nur von Wurzelspitzen von Keimlingen oder von Keimblättern erreichen. In ähnlicher Weise war die Isolation von Protoplasten aus Wurzel-haaren auch nur bei Wurzelspitzen von Keimlingen oder clusterlosen Seitenwurzeln möglich, jedoch nicht einmal bei sich gerade gebildeten Wurzelhaaren junger Clusterwurzeln.

Um den Einfluss eines zweiten Wachstumsfaktors zusätzlich zum P-Mangel auf den Citratstoff-wechsel zu untersuchen, wurde Weisslupine in Nährlösung und in Wurzelkästen bei 400 μmol mol-1 und 800 μmol mol-1 atmosphärischer CO₂-Konzentrationen angezogen. Die Pflanzenentwicklung war bei einer CO₂-Konzentration von 800 μmol mol-1 beschleunigt, und P-Mangel-und Seneszenzsymptome wie Gelbfärbung, Welke oder Abfallen der Blätter tra-ten viel früher auf. Bei Pflanzen in Nährlösung war das Sprosswachstum von der CO₂-Konzentration unbeeinflusst, das Wurzelwachstum jedoch bei 800 μmol mol-1 CO₂ viel höher. Im Gegensatz dazu war das Sprosswachstum bei Pflanzen in den Wurzelkästen leicht erhöht, aber das Wurzelwachstum unverändert. Jedoch die Ernte von größeren Mengen an Clusterwur-zeln von Pflanzen, die bei 800 μmol mol-1 CO₂ gewachsen waren, hat wahrscheinlich das Wur-zelwachstum vermindert. Der kalkhaltige Boden hat eventuell ebenfalls das Wurzelwachstum der Pflanzen in den Wurzelkästen beeinträchtigt. Ein bereits gestiegenes Wur-zel/Sprossverhältnis der unter P-Mangel gewachsenen Pflanzen war bei 800 μmol mol-1 CO₂ noch einmal erhöht. Die Anzahl der Cluster der Pflanzen in Nährlösung war bei 800 μmol mol-1 CO₂ von Tag 21 bis 33 nach Aussaat höher, danach verschwanden die Unterschiede jedoch wie-der. Die Anzahl der Clusterwurzeln pro Gesamtwurzelmasse wurden von untschiedlichen CO₂-Konzentrationen nicht verändert. Unabhängig von der Anzuchtmethode veränderten 800 μmol mol-1 CO₂ die Wurzelexsudation pro Cluster oder pro Clustergewicht ebenfalls nicht. Die Ver-teilung der Citrat- und Malatexsudation in den verschiedenen Wurzelabschnitten mit sinkender Malatexsudation und einer kurzfristigen extremen Citratexsudation in reifen Clusterwurzeln trat bei 800 μmol mol-1 CO₂ ebenso auf wie bei 400 μmol mol-1 CO₂. Die erhöhte Kohlenstoff-Verlagerung in die Wurzel bei 800 μmol mol-1 CO₂, feststellbar durch das größere Wurzel-Spross-Verhältnis, wurde nicht in eine höhere Exsudationsrate pro Cluster umgesetzt. Die Akti-vitäten der Sauren und Alkalischen Phosphatase in der Rhizosphäre von Lupinus albus nahmen während der Clusterwurzelentwicklung kontinuierlich zu, waren jedoch unabhängig von der CO₂-Konzentration. Die im wesentlichen unveränderten Phosphataseaktivitäten und die unveränderte Anreicherung und Abgabe von Citrat bei 400 und 800 μmol mol-1 CO₂ werden wahrscheinlich durch die eben-falls unveränderten Pi-Konzentrationen in den entsprechenden Wurzelabschnitten hervorgerufen, da die interne P-Konzentration diese Parameter zu bestimmen scheint. Da Citratanreicherung und Abgabe wahrscheinlich hauptsächlich durch die Rate des Citratabbaus geregelt wird, die unabhängig von der C-Versorgung ist, verändert eine erhöhte CO₂-Konzentration diese Parame-ter ebenfalls nicht. Entsprechend waren auch keine signifikanten Einflüsse des CO₂ auf die mi-krobielle Diversität in der Rhizosphäre der Weisslupine festzustellen. Nach bisherigen Erkenntnissen scheint die hohe Citratkonzentration in reifen Clusterwurzeln nicht durch einen einzelnen Faktor hervorgerufen zu werden, obwohl der Citratabbau offenbar wichtig ist und die Aconitase eventuell eine Schlüsselrolle spielt. Vielmehr scheint eine allge-meine Beeinträchtigung des Stoffwechsels durch nachlassende Konzentrationen an Pi, Adenyla-ten, und Protein verminderte Enzym -und Atmungsaktivitäten hervorzurufen. Verschiedene Re-gulationsmechanismen wie Phosphorylierung/Dephosphorylierung, der Einfluss von Phytohor-monen, oder Stickstoffmonoxid, müssen ebenfalls berücksichtigt werden.