Identifizierung von Zielmolekülen für die innovative Therapie pleuraler Mesotheliome : Untersuchung von Tyrosinkinasen sowie Komponenten der NF2/mTOR- und p14/p16-Signalwege

Abstract

Malignant pleural mesothelioma is a diffuse growing, rare form of cancer affecting the outer lining of the inner chest wall (pleura). About 90% of the cases are related to a prolonged exposure to asbestos. MPM is difficult to distinguish from other respiratory diseases and is therefore often diagnosed at late stages, when curative surgery is no longer a treatment option. Moreover, radiotherapy and chemotherapy only show limited efficacy, including a less than 5% five year survival rate. Targeting single molecules involved in progression, growth and metastasis with specific inhibitors might be a promising new approach for this tumour entity. However, till date there are no recommendations for targeted therapies in MPM. Although specific inhibitors of mTOR or single kinases suppressed MPM tumor growth in pre-clinical studies, they were not effective in clinical trials. Therefore, there is an urgent need to identify new treatment approaches and targets. The aim of this PhD thesis was to identify new therapeutical targets for the treatment of malignant pleural mesothelioma with special emphasis on the simultaneous inhibition of tyrosine kinases, p14/p16 and NF2/mTOR pathway molecules. Moreover it was focused on molecules within these pathways for which specific inhibitors are already available. One key aspect of this project was to examine mTOR and ALK as potential therapeutic targets, and to determine the efficacy of ALK and mTOR inhibition on tumor cell growth with ALK inhibitor Crizotinib and mTOR inhibitor Rapamycin, in individual and combinatorial treatment. Therefore, an ALK and mTOR co-expressing patient-derived MPM xenograft model was used. Crizotinib alone did not show anti-tumor efficacy whereas combined treatment with Rapamycin enhanced anti-tumor effect of Rapamycin treatment, and lead to a reduction in tumor volume in the MPM xenograft model. Simultaneous inhibition not only suppressed mTOR and ALK pathway transduction but also Rapamycin–induced AKT activation. Combined therapy significantly suppressed cell proliferation and induced autophagy as well as caspase-independent, necrotic cell death compared to the single treatment. Although only 5% of MPM tumors coexpress ALK and mTOR, the results of this study confirm that combined treatment with Rapamycin and Crizotinib can be a therapeutic treatment option in pleural mesothelioma. Further analyses included the investigation of p14/p16 regulator BMI1 as a therapeutic target for the treatment of MPM. Increased BMI1 expression was detected in 81.3% of the MPM patient samples analyzed. Coexpression of BMI1 and mTOR, a prerequisite for combined therapy, was present in 25% of the analyzed cases, as detected by qRT-PCR and IHC. Monotherapy with mTORC1/2 inhibitor INK-128, mTOR/PI3K inhibitor BEZ235 and BMI1 inhibitor PTC-209 resulted in dose-dependent reduction of cell viability in three MPM cell lines tested. Co-treatment with mTOR inhibitors enhanced therapeutic effect of BMI1 inhibition 2-fold (BEZ235) and 10-fold (INK-128) respectively, thus representing an appealing approach for targeted therapy in MPM. The last part of the project aimed to identify new therapeutic targets by genome-wide, array-based CNV- analysis of 42 MPM. Array-based ONCOSCAN technology, especially developed for formalin-fixed and paraffin-embedded tissue, and GISTIC algorithm identified new gains on chromosome 9p22.2, 13q34 and chromosome 19 (19p13.3, 19p13.11 and 19q13.2), which were verified via qPCR and FISH. GISTIC-reanalysis of previously published data sets provided genomic data of 182 MPM tumors in total and was used to identify critical regions for further research on new target genes like oncogenic kinases AKT1, AKT2, MAP3K10 and PTK2 among others. AKT2 and MAP3K10 gene and protein expression was elevated in the tested MPM cohort. Especially AKT isoforms AKT1 and AKT2 represent attractive targets with important therapeutic potential, since pan-AKT inhibitor Ipatasertib is currently being tested in clinical trials for other tumors. In conclusion, the results of this PhD thesis demonstrate the potential for small molecule inhibitors as therapeutic strategies for the treatment of malignant pleural mesothelioma. Moreover, the results of this study suggest that the concurrent inhibition of mTOR, ALK and AKT pathways is a viable therapeutic strategy, as these pathways are frequently simultaneously activated in pleural mesothelioma.

Pleurale Mesotheliome (MPM) sind diffus wachsende Tumore der Pleura, die in 90% der Fälle auf eine Asbestexposition zurückgeführt werden können. Die Diagnosestellung erfolgt meist spät, wenn eine chirurgische Resektion mit kurativer Intention nicht mehr in Frage kommt. Weil Pleuramesotheliome zudem überwiegend resistent gegenüber Strahlentherapie und Chemotherapeutika sind, zählen sie zu den besonders schwer behandelbaren Tumoren, bei denen weniger als 5% der Patienten länger als fünf Jahre überleben. Die zielgerichtete Therapie, die auf der Inhibierung aberrant aktivierter Moleküle durch spezifische Inhibitoren beruht, stellt eine vielversprechende Behandlungsstrategie dar. In präklinischen Studien konnten spezifische Inhibitoren von mTOR oder einzelnen Kinasen das Wachstum von Mesotheliomzellen hemmen, allerdings war keiner der Inhibitoren in klinischen Studien als Monotherapie effizient genug. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, neue Zielmoleküle für eine gerichtete Therapie des pleuralen Mesothelioms zu identifizieren. Dabei sollten insbesondere Tyrosinkinasen und Komponenten des p14/p16- und NF2/mTOR-Signalwegs und die Effekte einer simultanen Inhibierung untersucht werden. Im Fokus standen Moleküle, die als Teil dieser Signalwege auch in anderen Tumorentitäten aktiv sind und für die deshalb spezifische Inhibitoren verfügbar sind. Das erste Teilprojekt sollte die Frage beantworten, ob die Hemmung der Tyrosinkinase ALK mittels Crizotinib allein oder in Kombination mit dem mTOR-Inhibitor Rapamycin das Wachstum von MPM-Tumoren effizient hemmen kann. Dazu wurde eine in vivo-Therapiestudie mit einem Mesotheliom-PDX-Modell, welches ALK und mTOR koexprimierte, durchgeführt. Crizotinib allein war nicht wirksam, verstärkte jedoch die therapeutische Wirkung von Rapamycin und induzierte - erstmalig nachgewiesen - eine Verringerung des Tumorvolumens in einem MPM-Xenograft-Modell. Die simultane Inhibierung von mTOR und ALK supprimierte nicht nur die mTORC1- und ALK-Signaltransduktion, sondern auch die durch Rapamycin induzierte AKT-Aktivierung. Die Kombinationstherapie inhibierte die Tumorzellproliferation und induzierte Autophagie. Apoptose wurde nicht induziert, jedoch ein Caspase-unabhängiger, nekrotischer Zelltod. Auch wenn nur 5% der MPM-Patiententumore ALK und mTOR gleichzeitig exprimieren, konnte diese Studie zeigen, dass es prinzipiell möglich ist, Mesotheliome durch eine geeignete Kombinationstherapie effizient zu therapieren. Im zweiten Projekt wurde erstmals die Eignung des p14/p16-regulierten Transkriptionsfaktors BMI1 als Zielmolekül für die Therapie von MPM untersucht. Eine erhöhte BMI1-Transkriptexpression wurde in 81,3% der MPM-Patiententumore nachgewiesen, eine Koexpression mit mTOR – Voraussetzung für eine Kombinationstherapie – in 25% der untersuchten Fälle. In vitro-Therapieversuche mit dem BMI1-Inhibitor PTC-209 und den mTOR-Inhibitoren INK-128 und BEZ235 an MPM-Zelllinien ergaben, dass die Einzeltherapie mit den mTOR-Inhibitoren sowie PTC-209 in allen Zelllinien zu einer dosisabhängigen Reduzierung der viablen Zellen führte. Die kombinierte Therapie mit mTOR-Inhibitoren und BMI1-Inhibitor verstärkte den therapeutischen Effekt um das 2fache (BEZ235) bzw. 10fache (INK-128), verglichen mit der PTC-209 Monotherapie. Die Hemmung von BMI1 – insbesondere in Kombination mit einem Inhibitor des PI3K/mTOR-Signalweges – stellt somit einen attraktiven Ansatz für eine zielgerichtete Therapie des MPM dar. In einem dritten Teilprojekt sollten neue Zielmoleküle für eine gerichtete Therapie durch eine genomweite, arraybasierte CNV-Analyse an MPM-Patiententumoren identifiziert werden. Dadurch wurden signifikante, bisher nicht für MPM beschriebene genomische Zugewinne, unter anderem auf 9p22.2, 13q34 und Chromosom 19 (19p13.3, 19p13.11 und 19q13.2), identifiziert. Die Verifizierung der kritischen Regionen erfolgte mittels qPCR und FISH. Durch die Reanalyse zweier bereits publizierter Datensätze war es möglich, genomische Daten von insgesamt 182 MPM-Tumoren zu analysieren. Mit dieser Herangehensweise wurden mehrere kritische genomische Regionen mit potentiellen Zielgenen identifiziert, darunter die onkogenen Kinasen AKT1, AKT2, MAP3K10 und PTK2. Für AKT2 und MAP3K10 wurde im Rahmen dieser Studie eine erhöhte Genexpression in MPM-Tumoren nachgewiesen. Insbesondere die AKT-Isoformen AKT1 und AKT2 stellen Targets mit großem therapeutischen Potential dar, weil mit dem pan-AKT-Inhibitor Ipatasertib ein Therapeutikum zur Verfügung steht, das aktuell in klinischen Studien getestet wird. Diese Arbeit liefert somit mehrere Ansatzpunkte für die Entwicklung molekular ausgerichteter Therapieoptionen für pleurale Mesotheliome. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen zudem, dass es für die Entwicklung einer wirksamen Therapie sinnvoll ist, eine simultane Inhibierung mehrerer Signalwege anzustreben, da im pleuralen Mesotheliom verschiedene Signalwege häufig gleichzeitig aktiv sind.