Regulation von NIMIN- und PR1-Genen aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. und Nicotiana tabacum (L.) in der Salicylat-abhängigen Pathogenabwehr

Abstract

Systemic acquired resistance (SAR) is an important defense mechanism of plants against a broad range of pathogens. NPR1 acts as a central regulator controlling the salicylic acid (SA)-dependent formation of SAR through interaction with TGA transcription factors leading to the induction of ?pathogenesis-related? (PR) proteins. The SA-activated expression of the PR1 genes in Arabidopsis thaliana (At) and Nicotiana tabacum (Nt) depends on cis-acting as-1-like elements with a TGACG sequence. This dissertation studies the functional relevance of NIMIN proteins and SA-dependent PR gene induction using the analysis of gene regulation. Arabidopsis has four NIMIN-genes ? N1, N2, N3 and N1b which interact independently of TGA transcription factors with NPR1. N1 and N2 have a common interaction motif and bind to the C-terminus of AtNPR1, whereas N3 binds to the N-terminus of AtNPR1. The binding site for the TGA transcription factors is located relatively central in the AtNPR1 protein. The analysis of the NIMIN gene expression in the SA-dependent signaling pathway of SAR as well as their possible involvement in the Jasmonic (JA) signaling network ought to offer new aspects for understanding the regulation of plant pathogen defense. The relevance of different as-1-like elements was studied by establishing a yeast one-hybrid system. N1b is likely to be an inactive pseudogene. Neither could transcripts be detected in untreated, SA- or JA-treated Arabidopsis plants nor was the construct N1b[GUS] with the 1135 bp 5?-region able to induce reporter gene expression in transgenic tobacco plants. Expression of N3 occurs constitutively at low levels and independently of NPR1. Treatment with SA or JA does not lead to induction of N3. Likewise, the N3 promoter is not affected by treatment with SA, JA, TMV and phytohormones. Reporter gene expression of the N3 promoter occurs constitutively in transgenic tobacco seedlings. In contrast, N1 and N2 are clearly SA-induced. After SA induction, the expression of N2 is immediate and long-lasting and regulated independently of NPR1. N1 is expressed transiently at a later point in time and is NPR1-dependent. The expression of both, N1 and N2, clearly occurs before PR1 gene expression. The analysis of GUS-reporter gene constructs confirms the early SA-dependent induction of the N1 and N2 promoters before activation of the NtPR1a promoter. Similar to the PR1a promoter, both NIMIN promoters can be induced by thiamine-HCl and show an inhibitory effect of the JA signaling network on the strength of reporter gene expression during simultaneous treatment with SA and JA. At the histological level, the N1 and N2 promoters display SA-dependent activation in leaf and root tissue of young tobacco seedlings. This activity clearly differs from the N3 promoter. The N2 promoter ? just like the AtPR1 and NtPR1a promoters ? contains an as-1-like element with a tandem repeat of TGACG, responsible for the SA sensitivity of the promoter. However the N2 as-1-like element structurally differs from the as-1-like elements in the PR1 promoters. In the N1 promoter a SA-responsive element was located in the region of -436 to -402 with respect to the translation starting point of the N1 gene. However, mutation of a TGATG repeat within this region did not result in a loss of promoter activity. Analysis of chimeric promoter constructs with foreign as-1-like elements showed that the different expression kinetics of PR1 and NIMIN genes are not encoded by the genetic information of the respective as-1-like elements. On the contrary, the as-1-like cis-acting elements affect the promoters? tissue specificity. Due to the integration of the N2-as-1-like element, the NtPR1a promoter, which is solely active in leaf tissue, adopts the typical NIMIN activity in root tissue. The presence of the 35S-as-1 element in the NtPR1a promoter leads to constitutional activation in root tissue. However, the activation in leaf tissue is still SA-dependent. In the yeast one-hybrid system, the interaction of TGA factors with as-1 and the as-1-like elements of the AtPR1, NtPR1a and N2 promoters shows only small differences in binding quality, whereas considerable differences can be detected in quantitative binding strength. Mutation of the as-1-like elements in the NtPR1a and N2 promoters results in the loss of TGA factor binding. The N1 promoter region from -436 to -399 contains a TGA binding site. Mutation of the contained TGATG repeat leads to a total loss of binding of TGA transcription factors. The neighbouring promoter context can exert both positive and negative influence on TGA factor binding. In case of the N1 promoter, the presence of adjacent promoter regions results in increased binding affinity of TGA factors. In contrast, additional NtPR1a promoter context shows a considerable reduction of TGA factor binding to as-1-like elements. Despite independent binding sites, NIMIN proteins and TGA transcription factors compete for binding of AtNPR1 in the yeast three-hybrid system. The presence of N1 and N3 thereby impedes interaction of TGA factors with NPR1, whereas simultaneous binding of N2 and TGA factor is possible without any restrictions. Binding of N1 or N2 simultaneously with N3 at the C- and N-termini of NPR1 also results in reciprocal interference suggesting a spatial folding of NPR1 where the N- and C-termini lie closely together.

Die systemisch aktivierte Resistenz (SAR) ist ein wichtiger Verteidigungsmechanismus der Pflanzen gegenüber Pathogenen. NPR1 übernimmt dabei die Rolle eines zentralen Regulators, der im Zusammenspiel mit TGA-Transkriptionsfaktoren die Salicylat (SA)-abhängige Ausbildung der SAR kontrolliert, die letztendlich zur Induktion von PR (pathogenesis-related) -Proteinen führt. Die SA-aktivierte Expression der PR1-Gene aus Arabidopsis thaliana (At) und Nicotiana tabacum (Nt) ist abhängig von as-1-ähnlichen cis-aktiven Elementen mit der Sequenz TGACG. In dieser Arbeit wurden neue Erkenntnisse zur funktionellen Bedeutung der NIMIN-Proteine und zur SA-abhängigen PR-Induktion gewonnen. In Arabidopsis gibt es 4 NIMIN-Gene - N1, N2, N3 und N1b, die unabhängig von TGA-Faktoren mit NPR1 interagieren. N1 und N2 besitzen ein gemeinsames Interaktionsmotiv und binden an den C-Terminus von AtNPR1, während N3 an den N-Terminus von AtNPR1 bindet. Relativ zentral in AtNPR1 liegt die Bindestelle für die TGA-Faktoren. Die Untersuchung der Expression der NIMIN-Gene im SAR-Signalweg sowie ihre mögliche Involvierung im Jasmonat (JA)-Signalnetzwerk sollte neue Hinweise zur Regulation der pflanzlichen Pathogenabwehr geben. Dabei wurde die Bedeutung von unterschiedlichen as-1-ähnlichen Elementen durch die Etablierung eines Hefe-Einhybridsystems analysiert. N1b ist vermutlich ein inaktives Pseudogen. Weder konnten in unbehandelten, SA- oder JA-behandelten Arabidopsis-Pflanzen Transkripte nachgewiesen werden noch war eine Konstruktion N1b[GUS] mit der 1135 Bp 5?-Region in der Lage, Reportergenexpression in transgenen Tabakpflanzen zu vermitteln. N3 wird in geringen Mengen konstitutiv und unabhängig von NPR1 exprimiert. Die Behandlung mit SA oder JA führt nicht zur Induktion von N3. Gleichermaßen lässt sich der N3-Promotor nicht durch die Behandlung mit SA, JA, TMV, H2O2 und Phytohormonen beeinflussen. Die Reportergenexpression des N3-Promotors erfolgt in Keimlingen transgener Tabakpflanzen konstitutiv. N1 und N2 sind dagegen eindeutig SA-induziert. Die Expression von N2 erfolgt nach einem SA-Stimulus unmittelbar und anhaltend und ist NPR1-unabhängig. N1 wird zu einem späteren Zeitpunkt transient exprimiert und ist dagegen NPR1-abhängig. Die Expression von N1 und N2 liegt dabei zeitlich klar vor der Expression des PR1-Gens. Die Analyse von GUS-Reportergenkonstruktionen bestätigt die zeitlich vorgezogene SA-abhängige Induktion des N1- und N2-Promotors vor der Aktivierung des NtPR1a-Promotors. Beide NIMIN-Promotoren lassen sich ? ähnlich dem NtPR1a-Promotor - außerdem durch Thiamin-HCl induzieren und zeigen bei gleichzeitiger Behandlung mit SA und JA einen reprimierenden Einfluss des JA-Signalnetzwerks auf die Stärke der Reportergenexpression. Auf histologischer Ebene zeigen der N1- und N2-Promotor eine SA-abhängige Aktivierung im Blatt- und Wurzelgewebe von jungen Tabakkeimlingen. Diese Aktivität unterscheidet sich klar vom N3-Promotor. Der N2-Promotor ? wie auch der AtPR1- und NtPR1a-Promotor ? besitzt ein as-1-ähnliches Element, das für die SA-Sensitivität des Promotors verantwortlich ist und das auf der Tandemwiederholung der Sequenz TGACG beruht Die Struktur des N2-as-1-ähnlichen Elements ist allerdings unterschiedlich zur Struktur der as-1-ähnlichen Elemente in den PR1-Promotoren. Im N1-Promotor konnte ein SA-responsives Element in der Region von -436 bis -402 bezogen auf den Translationsstart des N1-Gens lokalisiert werden. Die Mutation einer TGATG-Wiederholung in dieser Region ergab aber keinen Verlust der Promotoraktivität. Durch die Untersuchung chimärer Promotorkonstruktionen mit fremden as-1-ähnlichen Elementen konnte gezeigt werden, dass die unterschiedliche Kinetik der Expression von PR1- und NIMIN-Genen nicht durch die genetische Information der as-1-ähnlichen Elemente codiert wird. Im Gegensatz dazu üben die cis-aktiven Elemente eindeutig einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Promotoren aus. Der NtPR1a-Promotor, der nach SA-Induktion lediglich im Blattgewebe aktiv ist, übernimmt durch den Einbau des N2-as-1-ähnlichen Elements die NIMIN-typische Aktivität im Wurzelgewebe SA-induzierter Keimlinge. Die Anwesenheit des 35S-as-1-Elements im NtPR1a-Promotor führt zur konstitutiven Aktivität in den Wurzelspitzen. Im Blattgewebe ist aber weiterhin eine SA-abhängige Aktivierung nachzuweisen.- Im Hefe-Einhybridsystem zeigen sich bei der Interaktion von TGA-Faktoren mit as-1 und den as-1-ähnlichen Elementen des AtPR1-, NtPR1a- und N2-Promotors bei der Qualität der Bindung nur geringe Unterschiede, während deutliche Differenzen bei der quantitativen Bindungsstärke auftreten. Die Mutation der as-1-ähnlichen Elemente im NtPR1a- und N2-Promotor führt dabei zum Verlust der Bindung. In der N1-Promotorregion von -436 bis -399 ist eine TGA-Bindestelle vorhanden. Die Einführung von Mutationen in die enthaltene TGATG-Wiederholung führt zum vollständigen Verlust der Bindung von TGA-Transkriptionsfaktoren. Der angrenzende Promotorkontext kann sowohl einen positiven als auch einen negativen Einfluss auf die Bindung der TGA-Faktoren ausüben. Im Fall des N1-Promotors führt die Anwesenheit der umgebenden Promotorregion zu einer verstärkten Bindungsaffinität. Im Gegensatz dazu zeigt der zusätzliche NtPR1a-Promotorkontext eine deutliche Reprimierung der Anlagerung von TGA-Faktoren an das as-1-ähnliche Element. NIMIN-Proteine und TGA-Faktoren konkurrieren im Hefe-Dreihybridsystem trotz unabhängiger Bindestellen um die Bindung an AtNPR1. Die Anwesenheit von N1 und N3 behindert dabei die Interaktion von TGA-Faktoren mit NPR1, während eine gleichzeitige Bindung von N2 und TGA-Faktor ohne Einschränkungen möglich ist. Eine Bindung von N1 bzw. N2 gleichzeitig mit N3 am C- und N-Terminus von NPR1 führt ebenfalls zu einer gegenseitigen Behinderung und lässt auf eine räumliche Faltung von AtNPR1 schließen, bei der sich N- und C-Terminus nahe kommen.