Mechanismen der Mastzellaktivierung durch gram-negative Bakterien und Bakterienprodukte aus der Darmflora.

Abstract

The role of mast cells (MC) as effector cells in IgE dependent processes like the type 1 allergy has been known for a long time. During the decade, it has been shown that MC are also involved in other pathophysiological processes such as mucosal polyposis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowl disease, tissue fibrosis, and atherosclerosis. Furthermore, MC play an important role in the regulation of host defense against microbes, tissue remodeling processes, and neuro-immunology-interaction. The first aim of the present study was to clarify the question whether human intestinal MC express toll-like receptors (TLR), which recognize conserved bacterial and viral components, and can MC be activated through TLR-ligands. The second major focus of the present study was to investigate if the stimulation of human intestinal MC with different E. coli and Shigella strains, respectively, results in an activation of MC and to identify the underlying mechanism(s). Accordingly, human intestinal MC were isolated from surgery tissue with a mechanical and enzymatical protocol. The purity of the MC cultures used in all experiments was between 98 and 100% which was achieved by positive selection (MACS). We could show, that human intestinal MC express mRNA for TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, and 9. However, neither the stimulation with LPS (lipopolysaccharide, TLR 4 ligand), LTA (lipoteichoic acid, TLR 2 ligand), Zymosan (TLR 2 ligand), poly I:C (polyinosinic-polycytidylic acid, TLR 3 ligand), R848 (TLR 7/8 ligand), CpG (C poly G oligo-desoxy-nucleotide, TLR 9 ligand) and non CpG, respectively resulted in a release of histamine, leucotriens, TNF-alpha, or IL-8. Furthermore, mRNA expression levels of TNF-alpha and IL-8 were not induced by any of the treatments. Similar results where found when human intestinal MC were stimulated with E. coli (O101:H-) isolated from human faeces or the probiotic strain E. coli Nissle 1917. Even after stimulation with pathogenic bacteria strains such as the invasive S. flexneri M90T and the fimbriated E. coli, respectively, no induction of any of the parameters mentioned above was found. However, E. coli strains activate the intracellular signal molecule and transcription factors ERK1/2, c-Fos, and AP1, but this activation failed to induce a complete immune answer. In contrast, the hemolytic E. coli stains ATCC 25922 and ATCC 35218 provoked strong activation of intestinal MC. Using the isogenic hemolysin negative E. coli mutants and the hemolysin positive transformants of the probiotic E. coli Nissle 1917 it was shown, that human intestinal MC are sensitive target cells for E. coli alpha hemolysin. Stimulation of MC with sublytic concentration of hemolysin resulted in an induction of TNF-alpha, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 mRNA expression, the release of histamine as well as leucotrien. This activation was found to be regulated by calcium dependent signal cascades. Inhibition of intracellular signal molecules showed that the activation depends on L-typ calcium channels, calcineurin, NFAT and NFkappaB. Prolonged infection with hemolytic E. coli strains resulted in lysis of intestinal MC indicating a biphasic activation of hemolysin.

Die Rolle der Mastzelle (MC) als Effektorzelle in IgE-abhängigen Prozessen wie der Typ I Allergie ist seit langem bekannt. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass MC in weitere pathophysiologische Prozesse wie der Tumorentwicklung, rheumatoiden Arthritis, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED), Gewebsfibrose und Arteriosklerose involviert sind. Aber auch bei physiologischen Prozessen, z.B. der Abwehr von bakteriellen und parasitären Erkrankungen, der Wundheilung und Angiogenese sowie der Neuro-Immun-Interaktion, spielen MC eine Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle menschlicher Darm-MC bei der Immunantwort gegen Pathogene untersucht. Es wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1. Exprimieren menschliche Darm-MC Toll-like Rezeptoren (TLR), die konservierte Strukturen von Bakterien und Viren erkennen, und sind sie durch TLR-Liganden aktivierbar? 2. Führt die Infektion menschlicher Darm-MC mit verschiedenen E. coli und Shigellen Stämmen zur Aktivierung und welche Mechanismen liegen dieser Aktivierung zugrunde? Hierfür wurden MC mittels mechanischer und enzymatischer Aufbereitung aus der Mukosa chirurgischer Darmresektate isoliert. Nach Aufreinigung durch Positivselektion und mehrwöchiger Kultur betrug die MC-Reinheit 98-100%. Es konnte gezeigt werden, dass menschliche Darm-MC mRNA für TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 exprimieren, allerdings tolerant gegenüber TLR-Liganden sind. Stimulation menschlicher Darm-MC mit LPS (Lipopolysaccharide, TLR 4 Ligand), LTA (Lipoteichonsäure, TLR 2 Ligand), Zymosan (TLR 2 Ligand), poly I:C (polyinosinic-polycytidylic acid, TLR 3 Ligand), R848 (TLR 7/8 Ligand), CpG (C poly G oligo-desoxy-nucleotide, TLR 9 Ligand) bzw. Non CpG führten weder zur Freisetzung von Histamin, Leukotrienen, TNF-alpha oder IL-8, noch zur mRNA-Expression von TNF-alpha oder IL-8. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Infektion menschlicher Darm-MC mit dem Stuhlisolat E. coli (O101:H-) oder dem probiotischen Stamm E. coli Nissle 1917 beobachtet. Selbst die pathogenen Bakterien-Stämme, wie der invasive S. flexneri M90T und der FimH-exprimierende E. coli ORN 103(pSH2), induzierten keine signifikante Freisetzung der oben genannten Mediatoren. Zwar führten E. coli Stämme bei menschlichen Darm-MC zur Aktivierung der intrazellulären Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren ERK1/2, c-Fos und AP1. Diese Aktivierung reichte allerdings nicht aus, um eine vollständige Immunantwort auszulösen. Interessanterweise bewirkten die hämolytischen E. coli Stämme ATCC 25922 und 35218 eine starke Aktivierung menschlicher Darm-MC. Mit Hilfe isogener Hämolysin-negativer E. coli Mutanten und der Hämolysin positiven Transformante des probiotischen E. coli Nissle 1917 konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass menschliche Darm-MC sensible Effektorzellen für E. coli alpha Hämolysin sind. Sublytische Hämolysin Konzentrationen führten bei menschlichen Darm-MC über einen Kalzium-abhängigen Signalweg zur mRNA-Expression von TNF-alpha, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 und zur Freisetzung von Histamin und Leukotrienen. Der Einsatz von Inhibitoren intrazellulärer Signalmoleküle zeigte weiterhin, dass die durch Hämolysin bedingte Aktivierung der Zellen abhängig von L-Typ Kalzium Kanälen, Calcineurin und NFAT bzw. NFkappaB ist. Ansteigende Hämolysinkonzentrationen führten zur zweiten Phase der Aktivierung, die durch eine Lyse der Zellen gekennzeichnet war.