HPTLC-bioluminescence detection: methodological improvements and the application of the method to mouthwashes

Abstract

For the chemical analysis of food, drugs, and environmental samples it becomes more and more important to find substances of a certain (biological) activity. For this, several biological screening assays are available. One of the most versatile is the luminescent bacteria test according to an international norm (DIN EN ISO 11348), a rapid cuvette test on cytotoxicity. The assay employs the naturally bioluminescent bacterium Vibrio fischeri, which emits blue-green light under good living conditions. Because the energy-consuming luminescence metabolism is linked directly to the bacterium?s respiratory chain, a disturbance of the bacterium?s metabolism affects the luminescence, whereas the degree of toxicity is proportional to the luminescence inhibition. Major advantage was achieved by coupling this biotest with previous separation by high-performance thin-layer chromatography (HPTLC), which allowed for a screening for individual components. The workflow consists of sample application onto an HPTLC plate, separation, drying the plate, application of the Vibrio fischeri suspension, and detection with a light-sensitive CCD camera. In the resulting image, dark zones on a brightly luminizing background indicate substances that affect the bacteria?s metabolism. No suitable image evaluation program for the effective correction and quantitative evaluation of the image after Vibrio fischeri detection was available, which was regarded as a great disadvantage. In literature, adaptations of the special corrections based on the cuvette test calculations were described, including horizontal background correction and the recalculation of the sigmoid dose-response-relationship of the bacteria?s reaction. This served as a basis for the development of a new method using existing software which did not only perform the necessary calculations but was easy and convenient enough for use in routine evaluations. Furthermore, the process of applying the aqueous bacteria suspension onto the HPTLC plates was improved. Usually, application was done by dipping with the help of a dipping device. Especially for polar substances, however, it was observed that substances can start to dissolve during this process, leading to blurring and tailing of the zones on the plate. A simple rolling device consisting of commercially available household articles was constructed. To compare rolling with dipping, octhilinone and methylparaben were chosen as test compounds. The results of rolling were far superior to dipping. However, manual rolling depended on the person who did it, and it was not possible to control pressure and velocity. To overcome this problem, a prototype of an automated rolling device was constructed and built. After the successful process optimizations, the applicability of the HPTLC-bioluminescence assay was tested on commercial mouthwashes. Mouthwashes are likely to contain antimicrobial compounds, which are not necessarily indicated on the packaging. HPTLC with biodetection was used as a rapid screening method to detect zones of interest, which were further analyzed by conventional techniques like HPLC and GC. First, the reaction of Vibrio fischeri towards more than 40 standard substances was determined. This database was used for the analysis of six commercially available mouthwashes. It revealed that not only declared preservatives are used in mouthwashes, but also other antimicrobial compounds. These were especially constituents of essential oils having antibacterial properties (anethole, carvone, menthol, thymol), but are summarized as ?aroma?, which is in compliance with legal restrictions. A most interesting question concerns the bacteria?s condition on the HPTLC plate. For the brightly luminizing background, it must be assumed that the bacteria are well alive. But no clear statement can be given for bacteria in the dark zones: they might be dead, inhibited (maybe only temporarily), or absent due to water repelling effects of the zone?s compound. A basic attempt to answer this question was made by applying a combination of classical microbiological techniques. In this dissertation it could be shown that HPTLC coupled with Vibrio fischeri detection can successfully be used in practice and is well suited to complement conventional analytical techniques. This work is meant to serve as a guideline for further research and new applications.

Bei der chemischen Analyse von Lebensmitteln, Medikamenten und Umweltproben wird es immer wichtiger, Substanzen mit einer bestimmten (biologischen) Wirkung nachzuweisen. Hierfür stehen verschiedene biologische Screening-Assays zur Verfügung. Einer der universellsten ist der Leuchtbakterientest gemäß internationaler Norm (DIN EN ISO 11348), ein schneller Küvettentest auf Zytotoxizität. Für diesen Assay wird das von Natur aus biolumineszente Bakterium Vibrio fischeri eingesetzt, welches unter guten Lebensbedingungen blau-grünes Licht emittiert. Da der energieaufwändige Lumineszenz-Metabolismus direkt mit der Atmungskette des Bakteriums verknüpft ist, beeinflusst eine Störung des Bakterienstoffwechsels die Lumineszenz, wobei der Grad der Toxizität proportional zur Hemmung der Lumineszenz ist. Ein großer Fortschritt war die Kopplung dieses Biotests mit vorheriger Trennung durch die Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC), da dies ein Screening auf Einzelsubstanzen ermöglicht. Der Arbeitsablauf besteht aus Probenauftragung auf eine HPTLC-Platte, Trennung, Trocknen der Platte, Aufbringen der Vibrio fischeri-Suspension und Detektion mit einer lichtempfindlichen CCD-Kamera. Im resultierenden Bild zeigen dunkle Zonen auf einem hell lumineszierenden Hintergrund Substanzen an, die den Bakterienstoffwechsel beeinflussen. Für die effektive Korrektur und quantitative Auswertung des Bildes war kein geeignetes Bildauswerteprogramm vorhanden, was als großer Nachteil angesehen wurde. In der Literatur wurden Anpassungen der speziellen Korrekturen basierend auf den Berechnungen des Küvettentests beschrieben, einschließlich horizontaler Hintergrundkorrektur und Rückrechnung der sigmoiden Dosis-Wirkungsbeziehung der Bakterienreaktion. Dies diente als Basis für die Entwicklung einer neuen Methode unter Verwendung bestehender Software, die nicht nur die notwendigen Berechnungen durchführte, sondern auch einfach und komfortabel genug zu bedienen war, um sie routinemäßig für die Auswertung einzusetzen. Weiterhin wurde das Aufbringen der wässrigen Bakteriensuspension auf die HPTLC-Platten verbessert. Üblicherweise wurde diese durch Tauchen mit Hilfe eines Tauchgerätes aufgebracht. Besonders bei polaren Substanzen wurde jedoch beobachtet, dass die Substanzen dabei angelöst werden können, was zu Verlaufen und Tailing der Zonen auf der Platte führte. Aus kommerziell erhältlichen Haushaltsartikeln wurde ein einfaches Walzgerät konstruiert. Um Walzen und Tauchen zu vergleichen, wurden Octhilinon und Methylparaben als Testsubstanzen gewählt. Die Ergebnisse mittels Walzen waren denen des Tauchens weit überlegen. Allerdings hing das manuelle Walzen von der ausführenden Person ab, und es war nicht möglich, Druck und Geschwindigkeit zu kontrollieren. Um dieses Problem zu bewältigen, wurde ein Prototyp eines automatischen Walzgerätes konstruiert und gebaut. Nach diesen erfolgreichen Prozessoptimierungen wurde die Anwendbarkeit des HPTLC-Biolumineszenz-Assays an kommerziellen Mundspüllösungen getestet. Mundspüllösungen können antimikrobielle Bestandteile enthalten, welche nicht unbedingt auf der Packung angegeben sein müssen. HPTLC mit Biodetektion wurde als schnelle Screeningmethode eingesetzt, um die interessierenden Zonen zu detektieren, welche dann mit konventionellen Techniken wie HPLC und GC weiter untersucht wurden. Zunächst wurde die Reaktion von Vibrio fischeri auf mehr als 40 Standardsubstanzen bestimmt. Diese Datenbasis wurde für die Untersuchung von sechs kommerziell erhältlichen Mundspüllösungen verwendet. Es zeigte sich, dass in Mundspüllösungen nicht nur deklarierte Konservierungsstoffe, sondern auch andere antimikrobielle Substanzen verwendet werden. Diese waren hauptsächlich Bestandteile ätherischer Öle mit antibakteriellen Eigenschaften (Anethol, Carvon, Menthol, Thymol), die jedoch in Übereinstimmung mit den rechtlichen Vorschriften unter ?Aroma? zusammengefasst wurden. Eine sehr interessante Frage betrifft das Schicksal der Bakterien auf der HPTLC-Platte. Für den hell leuchtenden Hintergrund muss angenommen werden, dass die Bakterien leben. Für die Bakterien in den dunklen Zonen kann jedoch keine klare Aussage getroffen werden: sie könnten tot, gehemmt (eventuell nur temporär), oder aufgrund wasserabstoßender Effekte der Substanz in der Zone nicht vorhanden sein. Durch Kombination klassischer mikrobiologischer Techniken wurde ein einfacher Versuch gemacht, diese Frage zu beantworten. In dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass die Kopplung der HPTLC mit Vibrio fischeri-Detektion erfolgreich in der Praxis eingesetzt werden kann und die Methode zur Vervollständigung konventioneller Analysetechniken gut geeignet ist. Diese Arbeit soll als Leitfaden für die weitere Forschung und neue Anwendungen dienen.