Characterisation of natural and synthetic nitrification inhibitors and their potential use in tomato cultivation

Abstract

Summary Besides commercial NIs, many chemicals could also inhibit nitrification. In our study (Chapter 3) regarding efficiency of chloride compared to 3,4-Dimethylpyrazole phosphate (DMPP), it was found that chloride at applied concentration of 30.5 mg per 100g dry soil, could effectively inhibit nitrification. Despite a lag period of 3 weeks in detectable net nitrification, inhibitory effect of chloride continued to persist even after 7 weeks of soil incubation compared to control. Nevertheless, DMPP particularly with higher concentration (2 % of N-NH4+ instead of 1%) stabilized ammonium more strongly than Cl-1. The extent of nitrification inhibition after 5 and 7 week of incubation was in order of: (2 % of N-NH4+) DMPP > (1 % of N-NH4+) DMPP> NH4Cl > KCl > control. The residue ammonium in the soil as well as the produced nitrate concentrations in samples showed a significant NI activity of chloride in both forms NH4Cl and KCl. Nitrification-induced pH decrease, however, showed a better correlation with measured nitrate than ammonium in this experiment. In a second series of experiments undertaken to identify whether the reported NI release by Brachiaria humidicola accession 26159 is an active or passive phenomenon, root exudates of plants grown under various treatments, have been collected in distilled water or in 1 mM NH4Cl. Under various pre-culture conditions such as N form (NH4+ versus NO3-), N concentrations (1, 2, 4 mM), light intensities (180, 240, 350 µmol m-2 s-1), plant age (3-weeks old versus 7-weeks old) and collecting periods (24 versus 6 h), there was no significant NI activity when root exudates were collected in distilled water. However, NI activity was detectable in root washings when the plants were exposed to extended collection times (24 h) in combination with NH4+ supply, but not after short term collection (6 h) or with NO3- in the collection solution. This observation is consistent with the results of Subbarao et al., (2006, 2007), but it also strongly suggests that the observed release of NI compounds was rather a consequence of membrane damage (passive phenomena) due to inadequate collection conditions, than mediated by controlled exudation from undamaged roots. It has been assumed that supplying only ammonium (1 mM) in distilled water as root washing medium over extended time periods (24 h) could lead to rapid ammonium uptake and medium acidification associated with the risk of Ca2+ desorption, which is an important element required for membrane stabilisation and integrity. To test the hypothesis that NI compounds are released from damaged plant cells of Brachiaria, the NI potential of fresh root and shoot homogenates was measured after soil incorporation and incubation. Surprisingly, NI potential was detected in shoot but not in root homogenates. The NI effect of soil-incorporated shoot tissues lasted for at least 8 d, while root tissue even stimulated nitrification with increasing incubation time. This NI effect was independent of the N form. However, the variability of data increased with NO3- form, higher light intensity or higher N concentrations during plant pre-culture. Independent of N forms, further extraction and characterisation of NI compounds in shoot tissue of Brachiaria plants revealed a particularly high activity in the ethanol-soluble fraction, both in plants with NH4+ and NO3- pre-culture. In a third experiment, the role of Ca2+ ions on improvement of tomato growth under ammonium nutrition was investigated. In this experiment root damage, probably by membrane damage and cytosolic sensitivity were hypothesised to be the main cause of toxicity symptoms of NH4+ on tomato plants. At application of 2 mM N as NH4+, plant biomass, number of lateral shoots, and transpiration were strongly inhibited and an increased Ca2+ application into the nutrient solution counteracted these observed negative effects. Transpiration or water consumption was found to be a good indicator of plant performance under NH4+ nutrition. Plants grown under nitrate nutrition had the highest transpiration rates, as well as the best growth characteristics. There was a positive correlation between nitrate concentrations and transpiration rates. On the other hand, plants grown in ammonium (as control, or 3 and 6 split applications of NH4+ during 4 days) showed severe toxicity symptoms including growth inhibition and leaf abscission. However, when ammonium was applied together with 10 mM Ca2+ (as CaSO4), or in a buffered solution of pH 6.6 with CaCO3 (pH or/and Ca2+ effect), transpiration and other growth factors (e.g. root and shoot dry matter, number of lateral shoots), as well as the nutrients especially N concentrations in the biomass were significantly improved. In other words, shoot and particularly root growth inhibited when NH4+ treated plants (control and split applications) did not received CaSO4 or CaCO3. Micro molar concentrations of NH4+ in 6 split applications also could not prevent ammonium toxicity symptoms.

Zusammenfassung In der hier vorliegenden Studie (Kapitel 3) wurde die Effizienz von Chlorid mit dem kommerziellen Nitrifikationshemmstoff 3,4-Dimethylpyrazol-Phosphat (DMPP) verglichen. Es zeigte sich, dass 30.5 mg Chlorid/ 100g Boden zu einer sehr effektiven Hemmung der Nitrifikation führte. Trotz eines Zeitraums von drei Wochen, in dem unabhängig von der Behandlung keine Netto-Nitrifikation beobachtet werden konnte, induzierte Chlorid sogar noch nach einer Inkubationszeit von sieben Wochen im Vergleich zur Kontrolle eine Hemmung der Nitrifikation. Trotz allem verursachte DMPP, vor allem in einer erhöhten Konzentration (2% von N-NH4+ statt 1% von N-NH4+), im Vergleich mit Cl- eine stärkere Stabilisation von Ammonium. Die Effektivität der Hemmung der Nitrifikation nach fünf bzw. sieben Wochen war: (2% von N-NH4+)-DMPP > (1% von N-NH4+)-DMPP > NH4Cl > KCL > Kontrolle. Residuales Ammonium im Boden, aber auch die produzierte Nitratkonzentration in den Proben zeigten eine signifikante Nitrifikationshemmung durch beide Chloridformen, NH4Cl und KCl. Die durch die Nitrifikation induzierte Verminderung des pH-Werts zeigte in diesem Experiment jedoch eine bessere Korrelation mit dem gemessenen Nitrat als dem gemessenen Ammonium. In einer zweiten Serie von Modellversuchen sollte untersucht werden, ob es sich bei der in wissenschaftlichen Untersuchungen beobachteten Abgabe von Nitrifikationshemmstoffen durch Brachiaria humidicola Genotyp 26159 um einen aktiven oder um einen passiven Prozess handelt. Die Wurzelexsudate von Brachiaria humidicola 26159 wurden in destilliertem Wasser oder 1mM NH4Cl gesammelt und auf die Fähigkeit zur Nitrifikationsinhibition geprüft. Unter Variation der Form der Stickstoffernährung (NH4+ oder NO3-), N-Konzentration (1, 2, 4mM), Lichtintensität (180, 240, 350 µmol m-2 s-1), Pflanzenalter (drei Wochen oder sieben Wochen) und der Dauer der Wurzelexsudationssammlung (6h oder 24h) zeigte sich keine signifikante Hemmung der Nitrifikation, wenn die Wurzelexsuadate in destilliertem Wasser gesammelt wurden. Im Gegensatz dazu konnte eine Hemmung der Nitrifikation in den Wurzelexsudaten detektiert werden, wenn die Pflanzen mit NH4+ aber nicht mit NO3- ernährt wurden und die Sammlung einen Zeitraum von 24 Stunden erfolgte. Dies bestätigt die Beobachtungen von Subbarao et al. (2006, 2007), weist jedoch auch darauf hin, dass die beobachtete Abgabe von Nitrifikationshemmstoffen eher die Konsequenz einer Membranschädigung (passiver Prozess), versucht durch eine inadäquate Bedingungen zur Sammlung von Wurzelexsudaten, war und keine kontrollierte Wurzelexsudation aus intakten Wurzelzellen darstellt. Es wird angenommen, dass die Zugabe von Ammonium (1mM) in destilliertes Wasser als Wurzelwaschmedium über einen Zeitraum von 24 Stunden eine schnelle Aufnahme von Ammonium mit Ansäuerung des Mediums verursachen kann, verbunden mit einer Desorption von Ca2+, einem der wesentlichen Faktoren für die Membranstabilisierung . Um zu testen, ob Nitrifikationshemmstoffe auf geschädigten Pflanzenzellen von Brachiaria humidicola abgegeben werden können, wurde das Nitrifikationsinhibitionspotenzial von homogenisiertem Wurzel- und Sprossgewebe nach einer Inkorporation in Bodenproben getestet. Erstaunlicherweise konnte ein Potenzial zur Nitrifikationshemmung im Spross- aber nicht in Wurzelhomogenaten nachgewiesen werden. Der Nitrifikationsinhibierende Effekt des Sprossgewebes hielt im Boden etwa acht Tage an, während Wurzelgewebe im mit zunehmender Inkubationszeit sogar zu einer Stimulation der Nitrifikation führte. Die nutrifikationshemmung durch inkorporiertes Sprossgewebe war unabhängig von der N-Form. Jedoch stieg die Variabilität der Daten bei NO3--Angebot, erhöhter Lichtintensität, oder höheren N-Konzentrationen. Eine chemische Fraktionierung der Nitrifikationsinhibitoren im Sprossgewebe ergab eine besonders hohe aktivität in der Ethanol-extrahierbaren Fraktion, sowohl für Pflanzen, die mit NH4+ als auch mit NO3-vorkultiviert worden waren. In einem vierten Experiment wurde die Rolle von Ca2+-Ionen für eine Verbesserung des Pflanzenwachstums von Tomaten bei einer Ammonium-Ernährung untersucht. Bei einer Applikation von 2mM als NH4+ waren die Biomasse der Pflanzen, laterale Sprossbildung und die Transpiration stark vermindert. Eine zunehmende Ca-Applikation in die Nährlösung konnte die beobachteten negativen Effekte kompensieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die Transpiration bzw. der Wasserverbrauch gute Indikatoren für die Entwicklung von Pflanzen im Falle einer NH4+-Ernährung sind. Pflanzen mit Nitraternährung zeigten eine höhere Transpiration und eine Verbesserung anderer Wachstumscharakteristika. Es zeigte sich eine positive Korrelation zwischen Nitraternährung und Transpiration. Pflanzen, die mit Ammonium (als Kontrolle, oder als Split-Applikation von NH4+ über 4 Tage) kultiviert wurden, zeigten ausgeprägte Symptome einer NH4+-Toxizität, darunter Wachstumshemmung und Blattfall. Jedoch, wenn Ammonium zusammen mit 10mM Ca2+ (als CaSO4), oder in eine mit CaCO3 bei pH 6.5 gepufferte Lösung (pH und/oder Ca2+ Effekt) appliziert wurde, war die Transpiration und andere Wachstumsparameter (v.a. Wurzel- und Spross-Biomasse, Bestockung) aber auch die N-Konzentrationen in den Pflanzen verbessert. Mit anderen Worten, das Spross- und Wurzelwachstum von Pflanzen wurde gehemmt, wenn NH4+-ernährte Pflanzen (Kontrolle und Split-Applikationen) nicht mit CaSO4 oder CaCO3 behandelt wurden. Auch durch die Applikation mikromolarer Konzentrationen von NH4+ (in einer in 6 Applikationen aufgeteilten Split-Applikation) konnte die Ausbildung von NH4+-Toxizitätssymptomen nicht verhindert werden.