Steuerungsmechanismen der Spermatogenese beim Eber: Auswirkungen einer GnRH-Immunisierung und anschließender Estradiolinfusion

Abstract

Whereas the regulation of spermatogenesis is well known in various species, specific differences, however, exist for the boar, which require species-specific investigation. High concentrations of estrogens are synthesized in the boar testis. It is known, that they play a synergistic role for male behaviour and function of accessory sex glands. Additionally, estrogens in the ejaculate reach the female genital tract and contribute to sperm transport and ovulation in the sow. A possible involvement of estrogens in spermatogenesis, however, was not investigated so far. Similarly, high concentrations of glucocorticoids occur in the tubuli of mature boars. Their regulatory function in spermatogenesis so far is unknown. For clarification, boars were actively immunized against GnRH. GnRH stimulates gonadotropin-release from the pituitary. The evaluation of hormone concentrations in blood plasma after GnRH immunization showed unexpectedly, that the gonadotropin FSH is not influenced, whereas LH- and in consequence steroid- (androgen and estrogen) concentrations were abolished. This offers the possiblity to characterize the selecitve function of estrogens in the presence of FSH. Three groups were evaluated: intact boars (n=5), immunized boars (n=5), 17ß-estradiol infused, immunized boars (n=6). All animals were fitted with indwelling cephalic vein catheters on both sides. One of them was reserved for infusion, the other one for uncontaminated blood sampling. All animals were infused with physiological saline over 7 weeks. For the 17ßEstradiol infused, immunized boars, a defined concentration of estradiol was added to the solution. Blood samples were collected over the whole 7-week period for LH, FSH, testosterone and estradiol. Blood samples were later analysed by established radioimmunological procedures. At the end of the 7-week period, all animals were killed. Tissue samples were fixed for histological examination. Morphological criteria included e.g. tubular diameter, seminiferous epithelial height and number of Leydig cells. Imunocytochemical evaluation was performed for mitosis (Ki-67), apoptosis (TUNEL) and the glucocorticoid receptor. The number of germ cell in the tubuli was reduced by 60% in immunized boars compared to the intact controls. These changes were explained by a more pronounced expression of the glucocorticoid receptor in spermatogonia, followed by the appearance of apoptosis in spermatogonia and primary spermatocytes. In consequence these findings demonstrate for the first time an involvment of glucocorticoids in the quantitative regulation of spermatogenesis. They counteract tubular mitosis by reducing the number of germ cells by apoptosis. In the 17ßestradiol infused group of immunized boars, the infusion led to the restoration of physiological estradiol concentrations (230 pg/ml) in peripheral blood plasma. As expected, androgen concentrations were minimal, so that the specific role of estrogens for spermatogenesis could be clarified. Data from the histological evaluation showed, that the expression of the estrogen receptor alpha occured in spermatogonia, selectively in the mitotic active stage of the seminiferous epithelial cycle leading to a 41-50% rise of germ cell numbers compared to immunized boars. The apoptotic rate in the tubuli of the estradiol infused boars however was not changed compared to immunized boars, so that physiological sperm numbers as they are characteristic for intact boars, were not reached. This study shows for the first time that both glucocorticoids and estrogens play an essential role for spermatogenesis in the boar. They are involved in the regulation of sperm yield by influencing the mitosis-apoptosis equilibrium in the tubuli of boars.

Grundsätzlich ist die Regulation der Spermatogenese bei landwirtschaftlichen Nutztieren, nicht zuletzt wegen der Bedeutung für das Verfahren der künstlichen Besamung, gut untersucht. Beim Eber ergeben sich allerdings Besonderheiten. So ist zwar bekannt, dass die hohen Mengen testikulärer Estrogene Bedeutung für verschiedene Reproduktionsfunktionen des männlichen Tieres und aufgrund hoher Konzentrationen im Ejakulat auch für das Fortpflanzungsgeschehen der Sau haben. Nicht geklärt ist allerdings eine mögliche Bedeutung der Estrogene für die Spermatogenese beim Eber. Ebenso ist unbekannt, inwieweit die aus der Nebenniere stammenden Glucocorticoide, die ebenfalls in den Samenkanälchen nachweisbar sind, Spermatogenese regulierende Funktionen haben. Um diese Fragestellungen zu klären, wurden Eber aktiv gegen GnRH immunisiert. GnRH steht an der Spitze der hodenregulierenden endokrinen Kaskade und reguliert insbesondere die Gonadotropin-Freisetzung aus der Hypophyse. Die Auswertung der Hormonverlaufskurven im Blutplasma ergab überraschenderweise, dass das Gonadotropin FSH durch die Immunisierung völlig unbeeinflusst blieb, während das Gonadotropin LH und damit die Steroidhormonbildung (Estrogene und Androgene) auf minimale Konzentrationen reduziert waren. Damit ergab sich die Möglichkeit, die selektive Bedeutung der Estrogene (unter Beibehaltung von FSH), näher zu untersuchen. Hierzu kamen 3 Gruppen zum Einsatz: intakte Eber (n=5), immunisierte Eber (n=5) und 17ßEstradiol-infundierte, immunisierte Eber (n=6). Alle Tiere wurden mit jeweils zwei Venenverweilkathetern versehen. Einer davon diente der Infusion, der andere der kontaminationsfreien Blutentnahme. Alle Tiere wurden über einen Versuchszeitraum von 7 Wochen mit physiologischer Kochsalzlösung infundiert. Dieser war bei den 17ßEstradiol-infundierten, immunisierten Ebern eine bestimmte Menge 17ßEstradiol zugesetzt. Über den gesamten Versuchszeitraum wurden Blutproben gewonnen. Am Ende des Versuchs wurden die Tiere eingeschläfert. Die gesicherten Blutproben wurden mit etablierten radioimmunologischen Meßverfahren (LH, FSH, Testosteron, Estradiol) ausgewertet. An den für die histologische Auswertung gesicherten Gewebsproben wurden morphologische Kriterien (u.a. Tubulusdurchmesser, Keimepithelhöhe, Leydigzellzahl) bestimmt. Zudem wurden weitere immuncytochemische Parameter erfasst, die Aufschluß über funktionelle Abläufe gaben (Mitose, Apoptose, GCR). Die erhaltenen Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Der Vergleich der Kontrolleber mit den immunisierten Ebern ergab eine etwa 60%ige Reduktion der Keimzellzahl in den Tubuli. Diese Veränderungen im Tubulusbereich lassen sich folgendermaßen erklären: Der Glucocorticoidrezeptor wurde von den Spermatogonien exprimiert, offenbar gefolgt vom Eintritt der Apoptose, die in Spermatogonien und primären Spermatozyten nachgewiesen wurde, also phasenverschoben zur Expression des Glucocorticoidrezeptors. Aufgrund dieser Befunde konnte erstmals aufgezeigt werden, dass die Glucocorticoide eine erhebliche Bedeutung für die quantitative Regulation der Spermatogenese haben dürften, indem sie gegensteuernd zur Mitose die Zahl der gebildeten Keimzellen apoptotisch reduzieren. Der Vergleich mit der zusätzlich untersuchten Gruppe mit Estradiol-Infusion, ergab zunächst, dass die Infusion im peripheren Blutplasma zur Wiederherstellung physiologischer Estradiolkonzentrationen von etwa 230 pg/ml führte, während die Androgenkonzentrationen erwartungsgemäß sehr niedrig lagen. Damit konnte spezifisch die Rolle der Estrogene für die Spermatogenese geklärt werden. So zeigten die Daten, dass die Expression des Estrogenrezeptors  in den Spermatogonien erfolgt und zwar spezifisch in jenen Keimepithelstadien, in denen auch die mitotische Aktivität während der Spermatogenese stattfindet. Dies stimmt mit den quantitativen Befunden zur Spermatogenese überein: Die Keimzellzahlen der 17ßE2-infundierten, immunisierten Eber waren im Vergleich zu den immunisierten Ebern wieder um 41-54 % erhöht. Immerhin zeigten aber die histologischen Daten, dass eine hohe Apoptoserate nach wie vor aufrechterhalten wird und damit in Zusammenhang auch nicht die normale Zahl reifer Spermien gebildet wird. Damit konnte insgesamt erstmals geklärt werden, dass sowohl Glucocorticoide als auch Estrogene beim Schwein eine essentielle Rolle für die Spermatogenese haben. Sie wirken sich insbesondere auf das Mitose-Apoptose-Gleichgewicht in den Tubuli aus und nehmen so Einfluss auf die Spermienausbeute.