Molecular regulation of components of root development and nutrient uptake in white lupin (Lupinus albus L.)

Abstract

White lupin (Lupinus albus L.) is specially adapted to sites with low availability of plant-available phosphorus (P), which is of particular agricultural importance because of chemical P fixation in the soil and limited reserves of P fertilizer resources. With special root structures, the cluster roots (syn. proteoid roots), it considerably increases the root surface area and excretes root exudates such as anions of organic acids, which make it possible to release phosphate ions from poorly soluble phosphate compounds in the soil and make them available to plants. The characteristic structure of these cluster roots usually consists of a lateral root with certain sections that have a significantly higher density of further lateral roots (rootlets) than the rest of the lateral root. In addition, the rootlets are evenly limited in length and, as they grow bundled in the cluster sections, the structure of cluster roots is reminiscent of a bottle brush. Cluster roots are also formed by other plant species such as some species from the Proteaceae family, but in contrast to these slow- growing and perennial woody plants, white lupin with its short life cycle and small size is an ideal model organism for the study of these special root structures. In addition to the mechanisms involved in the function of cluster roots, the regulation of formation and development of cluster roots is also of great importance for basic research in this field. Three studies were carried out as part of this thesis to examine these aspects in more detail. In order to better understand the functional mechanisms involved in the excretion of exudates, the hypothesis that the METAL AND TOXIN EXTRUSION (MATE) transport proteins LaMATE and LaMATE3 transport citrate was tested in the first study. The similarity of the gene sequences of these white lupin proteins with proteins from the MATE/DTX family, of which citrate transport is already known, as well as the increased gene expression of LaMATE and LaMATE3 in mature cluster roots led to this assumption. However, electrophysiological studies of the proteins with 13C- labeled citrate showed that LaMATE and LaMATE3 probably do not transport citrate and also the analysis of root exudates from transient loss-of-function mutants could not confirm the involvement of LaMATE in the transport of citrate. However, the excretion of the isoflavonoid genistein was found to be significantly reduced in the transient loss-of-function mutants, leading to the hypothesis that LaMATE may be involved in the exudation of isoflavonoids in mature cluster roots. As a result of the mobilization of phosphates through the excretion of organic acids, other cations such as manganese (Mn) also dissolve, which leads to increased Mn concentrations in the soil solution. As manganese uptake in the roots is not actively regulated, Mn accumulates in the plant, which has a toxic effect in higher concentrations. For this reason, white lupin needs a strategy to counteract toxic manganese accumulation, which was investigated in more detail in the second study. The observation that a greater increase in Mn concentration could be measured in the leaves than in the roots after elevated Mn exposure of white lupin indicates an actively regulated transport of excess Mn in the plant. The METAL TOLERANCE PROTEIN (MTP) AtMTP8 is involved in the detoxification of excess Mn in Arabidopsis and the increased gene expression of the corresponding white lupin homolog LaMTP8.1 in plants exposed to elevated Mn concentration suggested that LaMTP8.1 also fulfills a detoxification function. In further experiments, the ability of the LaMTP8.1 protein to transport Mn was demonstrated by heterologous expression of LaMTP8.1 in yeast cells. Furthermore, the high Mn concentrations in the leaves already indicated that the sink of Mn sequestration is located there and since AtMTP8 transports Mn into the vacuole, it was assumed that LaMTP8.1 could be localized in the tonoplast of the leaf cells to transport excess Mn into the vacuoles. This hypothesis was confirmed by homologous expression of LaMTP8.1 combined with a fluorescent marker in white lupin protoplasts. In summary, this study demonstrated that LaMTP8.1 is a vacuolar Mn transporter that mediates the transport of Mn into the vacuoles of leaf cells to detoxify excess Mn. While the first two studies addressed functional and physiological aspects of cluster roots, the third study focused on the mechanisms of formation and development of these root structures. To this end, the main focus was on the CLAVATA3/ EMBRYO SURROUNDING REGION (ESR)- RELATED (CLE) peptide family, of which some members regulate root growth in other plant species and enable more precise control of regulation compared to the known growth regulators auxin and cytokinin. In a comprehensive analysis, 30 known and further 25 new, putative CLE peptides were identified in Lupinus albus. Several of the CLE peptides were tested in a hydroponic system on young white lupins for their effects on root development and cluster root formation. The two CLE peptides LaCLE35 (RGVHyPSGANPLHN) and LaCLE55 (RRVHyPSCHyPDPLHN) showed striking inhibitory effects and altered both root growth and cluster root development in an inhibitory manner. The peptide LaCLE35 stood out in particular because it was the only CLE peptide detected in white lupin xylem sap and was therefore investigated in more detail. It was shown that LaCLE35 influences both the density and the length of cluster rootlets, and thus has an effect on the two crucial factors of cluster root formation. The inhibitory effect of CLE35 could be attributed to a suppression of cell elongation and further experiments with split-root setups showed that the externally added synthetic peptide LaCLE35 has a local but not a systemic effect. The investigations of the LaMATE transport proteins and LaMTP8.1-mediated Mn detoxification as well as the overview of the detected CLE peptides in white lupin and the analysis of the inhibitory influences of LaCLE35 on cluster roots form the basis of this thesis and aim to contribute to the understanding of the function, effects and formation of these special root structures.

Die Weiße Lupine (Lupinus albus L.) besitzt eine besondere Anpassung an Standorte mit einem Mangel an pflanzenverfügbarem Phosphor (P), was aufgrund der chemischen P-Fixierung im Boden und den begrenzten Reserven der Rohstoffe für P-Dünger agrarwirtschaftlich von besonderer Bedeutung ist. Mit speziellen Wurzelstrukturen, den Clusterwurzeln (syn. Proteoidwurzeln), erhöht sie die Wurzeloberfläche beträchtlich und scheidet Wurzelexsudate wie Anionen von organischen Säuren aus, mit deren Hilfe Phosphationen aus schwer löslichen Phosphatverbindungen im Boden freigesetzt und pflanzenverfügbar gemacht werden können. Der charakteristische Aufbau dieser Clusterwurzeln besteht in der Regel aus einer Seitenwurzel mit bestimmten Abschnitten, die eine deutlich höhere Dichte an weiteren Lateralwurzeln als die restliche Seitenwurzel aufweisen. Die Cluster-Lateralwurzeln sind zudem gleichmäßig in ihrer Länge begrenzt und da sie gebündelt in den Clusterabschnitten wachsen, erinnert die Struktur von Clusterwurzeln an eine Flaschenbürste. Clusterwurzeln werden auch von anderen Pflanzenarten wie einigen Arten aus der Familie der Proteaceae gebildet, jedoch ist die Weiße Lupine im Gegensatz zu diesen langsam wachsenden und mehrjährigen Gehölzen mit ihrem kurzen Lebenszyklus und der geringen Größe ein idealer Modellorganismus für die Erforschung dieser speziellen Wurzelstrukturen. Neben Mechanismen, die an der Funktion der Clusterwurzeln beteiligt sind, ist für die Grundlagenforschung auf diesem Gebiet auch die Regulation der Bildung und Entwicklung von Clusterwurzeln von großer Bedeutung. Für diese Arbeit wurden drei Studien angefertigt, um diese Aspekte genauer zu untersuchen. Um die funktionellen Mechanismen bei der Ausscheidung von Exsudaten genauer zu verstehen, wurde in der ersten Studie die Hypothese überprüft, dass die METAL AND TOXIN EXTRUSION (MATE) Transportproteine LaMATE und LaMATE3 Citrat transportieren. Die Ähnlichkeit der Gensequenzen dieser Proteine der Weißen Lupine mit Proteinen aus der MATE/ DTX Familie, von denen ein Citrattransport bereits bekannt ist, sowie die erhöhte Genexpression von LaMATE und LaMATE3 in reifen Clusterwurzeln führte zu dieser Annahme. Allerdings ergaben elektrophysiologische Untersuchungen der Proteine mit 13C-markiertem Citrat, dass LaMATE und LaMATE3 wahrscheinlich kein Citrat transportieren und auch die Analyse von Wurzelexsudaten aus transienten Loss-of-Function Mutanten konnte eine Beteiligung von LaMATE am Transport von Citrat nicht bestätigen. Allerdings stellte sich heraus, dass in den transienten Loss-of-Function Mutanten die Ausscheidung des Isoflavonoids Genistein deutlich reduziert war, was zu der Annahme führte, dass LaMATE an der Exsudation von Isoflavonoiden in reifen Clusterwurzeln beteiligt sein könnte. Als Folge der Mobilisierung von Phosphaten durch die Exkretion von organischen Säuren lösen sich auch andere Kationen wie Mangan (Mn), was zu erhöhten Mn-Konzentrationen in der Bodenlösung führt. Da die Manganaufnahme in den Wurzeln nicht aktiv reguliert wird, reichert sich Mn in der Pflanze an, was in höheren Konzentrationen toxisch wirkt. Aus diesem Grund braucht die Weiße Lupine eine Strategie um der toxischen Mangananreicherung entgegenzuwirken, welche in der zweiten Studie genauer untersucht wurde. Die Beobachtung, dass nach erhöhter Mn-Exposition der Weißen Lupine in den Blättern ein stärkerer Anstieg der Mn-Konzentrationen als in den Wurzeln gemessen werden konnte, wies darauf hin, dass der Transport des überschüssigen Mn in der Pflanze aktiv reguliert sein könnte. Das METAL TOLERANCE PROTEIN (MTP) AtMTP8 ist an der Entgiftung von überschüssigem Mn in Arabidopsis beteiligt und die erhöhte Genexpression des entsprechenden Homologs LaMTP8.1 der Weißen Lupine in Pflanzen, die einer erhöhten Mn-Konzentration ausgesetzt wurden, sprachen dafür, dass LaMTP8.1 ebenfalls eine Entgiftungsfunktion erfüllt. In weiteren Experimenten konnte durch eine heterologe Expression von LaMTP8.1 in Hefezellen die Fähigkeit des LaMTP8.1-Proteins zum Transport von Mn nachgewiesen werden. Weiterhin, deuteten bereits die hohen Mn-Konzentrationen in den Blättern darauf hin, dass die Senke der Mn- Sequestrierung dort liegt und da AtMTP8 Mn in die Vakuole transportiert, ergab sich die Annahme, dass LaMTP8.1 in der Vakuolenmembran der Blattzellen lokalisiert sein könnte, um überschüssiges Mn in die Vakuolen zu transportieren. Diese Hypothese konnte durch homologe Expression von LaMTP8.1 verbunden mit einem Fluoreszenzmarker in Protoplasten der Weißen Lupine bestätigt werden. Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass LaMTP8.1 ein vakuolärer Mn-Transporter ist, der den Transport von Mn in die Vakuolen der Blattzellen zur Entgiftung von überschüssigem Mn vermittelt. Während sich die ersten beiden Studien mit funktionellen und physiologischen Aspekten der Clusterwurzeln beschäftigten, wurde in der dritten Studie der Fokus auf die Mechanismen der Ausbildung und Entwicklung dieser Wurzelstrukturen gerichtet. Dafür wurde sich auf die CLAVATA3/ EMBRYO SURROUNDING REGION (ESR)-RELATED (CLE) Peptidfamilie konzentriert, aus der einige Vertreter in anderen Pflanzenspezies das Wurzelwachstum regulieren und im Vergleich mit den bekannten Wachstumsregulatoren Auxin und Cytokinin eine präzisere Steuerung der Regulation ermöglichen. In einer umfassenden Analyse wurden in Lupinus albus 30 CLE Peptide identifiziert, die bereits aus anderen Pflanzenarten bekannt waren. Zusätzlich wurden weitere 25 vermutliche CLE Peptide identifiziert, die zuvor unbekannt waren und zum ersten Mal beschrieben werden. Einige der CLE Peptide wurden in einem hydroponischen System auf ihre Effekte auf die Wurzelentwicklung und Clusterwurzelbildung von jungen Weißen Lupinen getestet wobei die beiden CLE Peptide LaCLE35 (RGVHyPSGANPLHN) und LaCLE55 (RRVHyPSCHyPDPLHN) auffällige, inhibitorische Effekte zeigten und sowohl das Wurzelwachstum als auch die Clusterwurzelentwicklung auf eine hemmende Art und Weise veränderten. Das Peptid LaCLE35 stach besonders hervor, da es als einziges CLE Peptid in der Xylemflüssigkeit der Weißen Lupine nachgewiesen werden konnte und wurde deshalb genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass LaCLE35 sowohl die Dichte als auch die Länge der Cluster- Lateralwurzeln beeinflusst, und damit eine Auswirkung auf die zwei zentralen Faktoren der Clusterwurzelbildung hat. Der hemmende Effekt von CLE35 konnte auf eine Unterdrückung der Zellstreckung zurückgeführt werden. In weiteren Experimenten mit getrennten Wurzelkompartimenten konnte außerdem gezeigt werden, dass das extern zugegebene synthetische Peptid LaCLE35 eine lokale aber keine systemische Wirkung hervorruft. Die Untersuchungen der LaMATE Transportproteine und der LaMTP8.1 vermittelten Mn- Detoxifizierung sowie der Überblick über die erfassten CLE-Peptide in der Weißen Lupine und die Analyse der hemmenden Einflüsse von LaCLE35 auf Clusterwurzeln bilden die Grundlage dieser Arbeit und sollen einen Beitrag zum Verständnis von Funktion, Wirkung und Bildung dieser besonderen Wurzelstrukturen leisten.