Bioprospecting for novel lipopeptide-producing strains for potential application in food and agriculture

Abstract

The need for sustainable alternatives to chemical products has been a huge topic in recent years and has put a demand on researchers and biotechnological companies to come up with bio-based alternatives to several chemical products. In line with this, interest in biosurfactants as alternatives to chemical surfactants is on the rise. Biosurfactants produced by microorganisms have great potential for application in detergents, personal care products, and pharmaceuticals, as well as in environmental, food processing, and agricultural applications. There are a few types of biosurfactants, including lipopeptides, which are primarily produced by Bacillus species and exhibit antimicrobial properties in addition to the well-known surface activity, surface tension reduction, and emulsifying ability of biosurfactants. Like other biosurfactants, lipopeptides have found more use in environmental applications such as bioremediation and microbial enhanced oil recovery (MEOR), while their use in agriculture and food industries remains limited due to concerns that may be related to acceptability, compatibility, and low yield by wild-type strains. To overcome these challenges, this thesis sought to find novel wild-type lipopeptide-producing strains from food-related sources that could be presumably safe for use in agriculture and food applications. To achieve this goal, a screening approach that combined several methods was adopted to identify potential high-yield wild-type, and possibly novel lipopeptide-producing strains. The ability of selected strains as promising biocontrol agents in agriculture was also evaluated. In Publication 1, potential lipopeptide-producing strains were isolated from food-related sources and screened for lipopeptide production. The screening approach combined microbiological and molecular identification of strains, with screening methods based on biosurfactant properties, as well as chemical analysis of surfactin production. Strains with promising lipopeptide-production potential belonging to three genera of Bacillus, Lysinibacillus and Priestia were identified. These strains included several exotic species that were either previously unknown or minimally studied with respect to LP production. Multiple strains that produced more than 150 mg L-1 surfactin, including a B. subtilis strain with a yield of about 1.5 g L−1 were discovered. In Publication 2, two promising LP-producing B. velezensis strains ES1-02 and EFSO2-04 were evaluated for their biocontrol potential and compared with commercial biocontrol strains B. velezensis QST713 and FZB42. The isolated strains demonstrated biocontrol ability comparable to QST713 against Diaporthe spp., which are notorious fungal pathogens of soybeans and other economically important crops. Co-incubation of strain ES1-02 with the phytopathogen D. longicolla induced a 10-fold increase in surfactin production. The broader molecular response of B. velezensis to plant pathogens investigated through an associated global proteome analysis showed the adaptation and response mechanisms of B. velezensis to plant pathogens. In general, B. velezensis seemed to adopt LP- modulation, physiological adaptation, and increased abundance of antimicrobial compounds as antagonistic and adaptation strategies for interaction with the phytopathogen D. longicolla. In Publication 3, genomic techniques were used in the discovery and description of a novel lipopeptides-producing species of the genus Lysinibacillus for which the name Lysinibacillus irui sp. nov. was proposed. This Gram-positive, motile, aerobic, rod-shaped, endospore-forming strain designated IRB4-01T was isolated from fermented African locust beans (Iru) and as such was named after Iru. A comprehensive chemotaxonomic analysis of the strain showed that the cell wall peptidoglycan type is A4α (Lys–Asp), and MK-7 is the major respiratory quinone. Detailed information about the polar lipids and major cellular fatty acids was also obtained. The G+C content of the genomic DNA was 37.4 mol%. Surfactin production by this novel strain was described in Publication 1 of this work.

Der Bedarf an nachhaltigen Alternativen zu chemischen Produkten war in den letzten Jahren ein bedeutsames Thema und hat Forscher und biotechnologische Unternehmen dazu veranlasst, biobasierte Alternativen zu verschiedenen chemischen Produkten zu entwickeln. In diesem Zusammenhang steigt dementsprechend auch das Interesse an Biotensiden als Alternativen zu chemischen Tensiden stetig an. Biotenside, die von Mikroorganismen hergestellt werden, haben ein großes Potenzial für den Einsatz in Reinigungsmitteln, Körperpflegeprodukten und Arzneimitteln sowie in den Bereichen Umwelt, Lebensmittelverarbeitung und Landwirtschaft. Dabei gibt es verschiedene Arten von Biotensiden, darunter Lipopeptide, die hauptsächlich von Bacillus-Arten produziert werden und neben ihrer bekannten Oberflächenaktivität, der Verringerung der Oberflächenspannung und der Emulgierfähigkeit, auch antimikrobielle Eigenschaften aufweisen. Wie andere Biotenside werden auch Lipopeptide verstärkt in umweltbasierten Anwendungen wie der Bioremediation und der mikrobiellen Ölgewinnung (MEOR) eingesetzt, während ihre Verwendung in der Landwirtschaft und der Lebensmittelindustrie aufgrund von Bedenken hinsichtlich der Akzeptanz, der Kompatibilität und der geringen Ausbeute von Wildtyp-Stämmen begrenzt bleibt. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, wurde in dieser Arbeit versucht, neuartige Lipopeptid-produzierende Wildtyp-Stämme aus lebensmittelnahen Quellen zu finden, die vermutlich sicher für den Einsatz in der Landwirtschaft und in Lebensmitteln sind. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein Screening-Ansatz gewählt, bei dem mehrere Methoden kombiniert wurden, um potenziell ertragreiche Wildtyp-Stämme zu identifizieren, die darüber hinaus möglicherweise neue Lipopeptide produzieren. Darüber hinaus wurde die Eignung der ausgewählten Stämme als mögliche biologische Schädlingsbekämpfungsmittel in der Landwirtschaft verifiziert. In der Publikation 1 wurden potenziell Lipopeptid-produzierende Stämme aus lebensmittelnahen Quellen isoliert und auf ihre Lipopeptidproduktion untersucht. Der Screening-Ansatz kombinierte die mikrobiologische und molekulare Identifizierung der Stämme mit Screening-Methoden, die auf den Eigenschaften von Biotensiden basieren, sowie mit der chemischen Analyse der Surfactinproduktion. Es wurden Stämme mit vielversprechendem Lipopeptid-Produktionspotenzial identifiziert, die zu den drei Gattungen von Bacillus, Lysinibacillus und Priestia gehören. Zu diesen Stämmen gehörten mehrere exotische Arten, die entweder bisher unbekannt waren oder deren LP-Produktion nur geringfügig untersucht wurde. Des Weiteren wurden mehrere Stämme entdeckt, die mehr als 150 mg L-1 Surfactin produzierten, darunter ein B. subtilis-Stamm mit einem Ertrag von etwa 1,5 g L-1. In der Publikation 2 wurden die zwei vielversprechenden LP-produzierenden B. velezensis-Stämme ES1-02 und EFSO2-04 hinsichtlich des Potenzials zur Biokontrolle untersucht und mit den kommerziellen Biokontrollstämmen B. velezensis QST713 und FZB42 verglichen. Die isolierten Stämme zeigten eine mit QST713 vergleichbare Biokontrollfähigkeit gegen Diaporthe spp., die entscheidende Pilzpathogene von Sojabohnen und anderen wirtschaftlich wichtigen Nutzpflanzen sind. Die Ko-Inkubation von Stamm ES1-02 mit dem Phytopathogen D. longicolla führte zu einer 10-fachen Steigerung der Surfactin-Produktion. Durch globale Proteomanalysen wurden generelle molekulare Reaktionen von B. velezensis auf Pflanzenpathogene, und damit verbundene Anpassungs- und Reaktionsmechanismen, aufgezeigt. Im Allgemeinen scheint B. velezensis die LP-Modulation, die physiologische Anpassung und eine erhöhte Menge an antimikrobiellen Verbindungen als antagonistische Anpassungsstrategien für die Interaktion mit dem Phytopathogen D. longicolla zu nutzen. In der Publikation 3 wurden Methoden im Genomics-Bereich zur Entdeckung und Beschreibung einer neuen Lipopeptid-produzierenden Spezies der Gattung Lysinibacillus eingesetzt, für die der Name Lysinibacillus irui sp. nov. vorgeschlagen wurde. Dieser Gram-positive, bewegliche, aerobe, stäbchenförmige, endosporenbildende Stamm mit der Bezeichnung IRB4-01T wurde aus fermentierten afrikanischen Johannisbrotbohnen (Iru) isoliert und als solcher nach Iru benannt. Eine umfassende chemotaxonomische Analyse des Stammes ergab, dass der Zellwand-Peptidoglykan-Typ A4α (Lys-Asp) vorliegt und MK-7 das wichtigste respiratorische Chinon ist. Es wurden auch detaillierte Informationen über die polaren Lipide und die wichtigsten zellulären Fettsäuren bereitgestellt. Der G+C-Gehalt der genomischen DNA betrug 37,4 mol%. Die Surfactin-Produktion durch diesen neuartigen Stamm wurde in der Publikation 1 dieser Arbeit beschrieben.