Strategies and mechanisms of cellular interaction between the parasitic weed Orobanche cumana WALLR. and its host Helianthus annuus L.

Abstract

Sunflower broomrape, Orobanche cumana WALLR., is a root parasitic plant causing considerable yield losses in sunflower cultivation in Europe, North Africa and Asia. Comprehensive knowledge about early interaction stages between host and parasite is necessary to find new ways of controlling this weed. In this thesis, three aspects regarding the biology of O. cumana were studied: 1) the chemotropism of O. cumana germtubes which bend towards the host root, 2) the development of O. cumana on resistant and susceptible sunflower lines and 3) the development of the phloem connection between the O. cumana haustorium and the sunflower host root. Sesquiterpene lactones in sunflower root exudates act as germination stimulants for O. cumana. As sesquiterpene lactones are known inhibitors of plant elongation growth and seem to play a role in the phototropic curvature of sunflower hypocotyls, a chemotropism bioassay on water agar was established to test if they also serve as chemotropic signals for the host-finding of O. cumana germtubes. When sesquiterpene lactone containing sunflower root exudate, sunflower seed oil extract or the sesquiterpene lactone reference costunolide were applied on filter discs, 70 % of the germtubes showed orientation towards them. The artificial strigolactone GR24, however, did not induce chemotropism. A concentration gradient of sesquiterpene lactones exudated from the host root is likely to be responsible for a stronger inhibition of elongation growth on the host-facing flank of the germtube. This would confer a double role of sesquiterpene lactones from root exudates in the sunflower-broomrape-interaction, namely as germination stimulants and as chemotropic signals. One way of controlling O. cumana is the cultivation of resistant sunflower lines. However, this resistance is rapidly overcome by more aggressive pathotypes of the parasite. Therefore, the resistance or tolerance reaction of the sunflower genotype T35001 was investigated in comparison to six other sunflower genotypes with different resistance characteristics. The development of O. cumana was monitored in a root chamber system which allowed permanent assessment of germination, attachment and tubercle formation in the different host-parasite-combinations. All seven tested sunflower lines induced germination and attachment of O. cumana, independent of the expected resistance or susceptibility of the host. A difference between compatibility or incompatibility of the interactions was only observed at the tubercle stage. On T35001, tubercles never occurred, neither in root chamber nor in pot experiments. To find out why the development stopped before the tubercle stage, samples of sunflower roots with attached O. cumana seedlings were analysed by bright field-, fluorescence- and transmission electron microscopy. Histological studies revealed that O. cumana penetrated the host root, but never reached the host’s vascular bundle. The root cortex cells surrounding the Orobanche haustorium showed no ultrastructural changes such as cell wall thickening. Fluorescence microscopy revealed no callose depositions or signs of phytoalexin release. However, ultrastructural examination of the host-parasite-interface showed degeneration processes in both cortex and haustorial cells. Cortex cells were flooded with bacteria, haustorium cells showed degeneration of cytoplasm and nuclei. The resistance mechanism that prevented further development of the O. cumana haustorium did not express itself in a histologically visible way. As holoparasite, O. cumana acquires its entire demand for water, minerals and organic nutrients from the host’s vascular system. The development of the xylem connection between O. cumana and sunflower had previously been reported, but the phloem connection is far more relevant for the parasite in terms of organic nutrients. Accordingly, the ultrastructure of the phloem connection between the haustorium of young O. cumana tubercles and the sunflower root was examined. Parasite and host tissues were intermingled at the contact site and difficult to distinguish, but sieve-tube elements of O. cumana and sunflower could be differentiated according to their plastid ultrastructure. While sieve-element plastids of O. cumana were larger, often irregular in shape and contained few, small starch inclusions, sieve-element plastids of the host were significantly smaller, always round with more and larger starch inclusions. This made it possible to trace the exact contact site of host and parasite sieve elements to show a direct symplastic phloem connection between the two species. The interspecific sieve plate showed more callose on the host side. This allowed detection of newly formed plasmodesmata between host sieve-tube elements and parenchymatic parasite cells, thus showing that undifferentiated cells of the parasite can connect to fully differentiated sieve elements of sunflower.

Die Sonnenblumen-Sommerwurz, Orobanche cumana WALLR., eine wurzelparasitische Pflanze, verursacht beträchtliche Ernteausfälle im Sonnenblumenanbau in Europa, Nordafrika und Asien. Umfassendes Wissen über frühe Interaktionsstadien zwischen Wirt und Parasit sind nötig, um neue Wege zur Bekämpfung des Parasiten zu finden. In dieser Arbeit wurden drei Aspekte der Biologie von O. cumana untersucht: 1) Der Chemotropismus von O. cumana-Keimschläuchen hin zur Wirtswurzel; 2) die Entwicklung von O. cumana auf resistenten und suszeptiblen Sonnenblumen-Linien; und 3) die Entwicklung der Phloem-Verbindung zwischen dem O. cumana-Haustorium und der Sonnenblumen-Wirtswurzel. Sesquiterpenlactone in Wurzelexsudaten der Sonnenblume induzieren die Keimung von O. cumana-Samen, sind auch als Inhibitoren des pflanzlichen Streckungswachstums bekannt und scheinen eine Rolle in der phototropen Krümmung von Sonnenblumen-Hypokotylen zu spielen. Um zu testen, ob sie auch als chemotrope Signale für die Wirtsfindung von O. cumana-Keimschläuchen verantwortlich sind, wurde ein Chemotropismus-Biotest auf Wasseragar entwickelt. Wenn sesquiterpenlactonhaltiges Sonnenblumenwurzelexsudat, Sonnenblumenölextrakt oder die Sesquiterpenlacton-Referenzsubstanz Costunolid auf Filterplättchen eingesetzt wurden, wuchsen 70 % der Keimschläuche auf diese zu. Das künstliche Strigolacton GR24 induzierte keinen Chemotropismus. Ein Konzentrationsgradient der von der Wirtswurzel exsudierten Sesquiterpenlactone scheint für eine stärkere Inhibierung des Streckungswachstums auf der dem Wirt zugewandten Keimschlauchseite verantwortlich zu sein. Dies würde den Sesquiterpenlactonen in Sonnenblumenwurzelexsudaten eine Doppelrolle in der Interaktion mit O. cumana zukommen lassen, nämlich als Keimstimulanzien und als Signale für den Chemotropismus. O. cumana kann durch den Anbau resistenter Sonnenblumenlinien bekämpft werden. Diese Resistenz wird jedoch von neuen, aggressiveren Pathotypen des Parasiten überwunden. Ziel war es daher, Resistenz- oder Toleranzreaktionen des Sonnenblumen-Genotyps T35001 im Vergleich zu sechs anderen Sonnenblumengenotypen mit unterschiedlichen Resistenzcharakteristika zu untersuchen. Ein Wurzelkammersystem erlaubte die kontinuierliche Beobachtung der Keimung, Anlagerung und Tuberkelbildung bei den unterschiedlichen Wirt-Parasit-Kombinationen. Alle sieben getesteten Sonnenblumenlinien induzierten die Keimung und Anlagerung von O. cumana, unabhängig von deren erwarteter Suszeptibilität oder Resistenz. Ein Unterschied zwischen kompatiblen und inkompatiblen Interaktionen wurde erst im Tuberkelstadium sichtbar. Auf den Wurzeln von T35001 entwickelten sich nie Tuberkel, weder in Wurzelkammer- noch in Topfversuchen. Warum die Entwicklung von O. cumana vor dem Tuberkelstadium stoppte, wurde licht-, fluoreszenz- und transmissionselektronenmikroskopisch untersucht. Die histologischen Studien zeigten, dass der Parasit zwar in die Wirtswurzel eindrang, aber nicht den Zentralzylinder erreichte. Die Wurzelrindenzellen, die das Orobanche-Haustorium umgaben, wiesen keine ultrastrukturellen Veränderungen auf, wie beispielsweise Zellwandverdickungen. Weder Kalloseablagerungen noch Zeichen für Phytoalexinproduktion waren mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar. Ultrastrukturelle Untersuchungen der Kontaktstellen von Wirt und Parasit zeigten jedoch Degenerationsprozesse sowohl in den Zellen der Wurzelrinde als auch in denen des Haustoriums. Die Wurzelzellen waren voller Bakterien, auch Zellkerne und Cytoplasma der Haustorienzellen erschienen degeneriert. Der Resistenzmechanismus, der die weitere Entwicklung des Haustoriums verhinderte, war histologisch nicht sichtbar. Als Holoparasit deckt O. cumana seinen gesamten Bedarf an Wasser, Mineralien und organischen Nährstoffen aus dem Leitbündelsystem des Wirtes. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die Ultrastruktur der Phloemverbindung zwischen dem Haustorium des jungen Tuberkels und der Wirtswurzel untersucht. Die Gewebe von Wirt und Parasit waren an den Kontaktstellen schwer zu unterscheiden, doch die Siebröhrenelemente konnten aufgrund ihrer Plastidenultrastruktur eindeutig zugeordnet werden. Während die Siebröhrenplastiden von O. cumana meist größer und unregelmäßig geformt waren und wenige kleine Stärkeeinschlüsse enthielten, waren die der Sonnenblume signifikant kleiner, immer rundlich und besaßen mehr und größere Stärkeeinschlüsse. Dies erlaubte es, die exakte Anschlussstelle zwischen Wirt und Parasit zu finden. Direkte symplastische Phloemverbindungen wurden zwischen den beiden Arten entdeckt. Die interspezifische Siebplatte wies auf der Wirtsseite stets mehr Kallose auf und ermöglichte somit die Identifizierung neu gebildeter Plasmodesmen zwischen parenchymatischen Haustorienzellen und Siebröhren der Sonnenblume. Undifferenzierte Orobanche-Zellen konnten sich also mit vollständig differenzierten Siebröhrenelementen der Sonnenblume verbinden.