Der Einfluss des Stammzellmarkers ALDH und des EGFR-PI3 Kinase-Akt Signalwegs auf die Strahlenresistenz humaner Tumorzelllinien

Abstract

Cancer is the second leading cause of death in industriated nations. Besides surgury and chemotherapy, radiotherapy (RT) is an important approch by which about 60% of patients are treated. The response of these patients to RT is very heterogenous. On the one hand, there are patients with tumors which are radiosensitive and can be cured, but on the other hand patients bear tumors which are quite resistant to radiotherapy. A Radioresistant phenotype of tumor cells causes treatment failure consequently leading to a limited response to radiotherapy. It is proposed, that radiotherapy outcome mainly depends on the potential of radiation on controlling growth, proliferation and survival of a specific population of tumor cells called cancer stem cells (CSCs) or tumor-initiating cells. Based on experimental studies so far reported it is assumed that the population of CSC varies in tumors from different entities and is relatively low compared to the tumor bulk cells in general. According to the CSC hypothesis, it might be concluded that the differential response of tumors to radiotherapy depends on CSC populations, since these supposedly slow replicating cells are able to initiate a tumor, to self renew indefinitely and to generate the differentiated progeny of a tumor. Besides the role of cancer stem cells in radiotherapy response, ionizing radiation (IR) activates the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream signaling pathways such as phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/Akt, mitogen-activated protein kinase (MAPK) and Janus kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription (JAK/STAT) pathways. Among these pathwas, PI3K/Akt is one of the most important pathways involved in post-irradiation survival: Activation of Akt results in activation of DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit (DNA-PKcs). DNA-PKcs is a core enzyme involved in repair of IR-induced DNA-double strand breaks (DNA-DSB) through non-homologous end joining (NHEJ). The aim of the present study was to investigate the role of CSCs in resistance of radioselected subclones of non-small cell lung cancer (NSCLC) and breast cancer cells to irradiation. Additionally, the role of EGFR dependent PI3K/Akt/DNA-PKcs signaling in the context of CSC-mediated radiotherapy resistance was investigated. The following major results were obtained: 1) Radioresistant tumor cells from NSCLC-A549 cells as well as SK-BR-3 breast cancer cells could be isolated in vitro by a radioselection process. 2) In line with the proposed CSC biological behaviors radioselected cells presented extended population doubling time and decreased plating efficiency. 3) Among identified potential CSC markers such as CD133, Oct-4, Sox2 or aldehyde dehydrogenase (ALDH) expression, solely expression of the embryonic stem cell marker Oct-4 was increased in the radio-selected SK-BR-3 cells. However, increased ALDH activity but not enhanced ALDH protein expression was associated with radioresis-tance of A549 cells. 4) Respectively, ALDH activity was found to be involved in radio-resistance partially through PI3K pathway. 5) Using an siRNA approach, a differential effect of ALDH1 vs ALDH2 in terms of post-irradiation survival of tumor cells was demonstrated. In this context and in contrast to the role of ALDH2 a prosurvival effect of ALDH1 could be observed. 6) Radioresistance of IR-selected tumor cells was partially mediated through EGFR/PI3K/DNA-PKcs-dependent accelerated repair of DNA-DSBs. Thus, based on the described major findings in this study it is proposed that targeting of PI3K/Akt pathway and ALDH1 might be effective approaches towards overcoming CSC-mediated radiotherapy resistance.

Krebserkrankungen sind weltweit die zweithäufigste Todesursache in Industrie-nationen. Neben der chirurgischen Entfernung und chemotherapeutischen Behandlung des Tumors ist Bestrahlung die wichtigste Therapieform, die heutzutage ca. 60% der Patienten erhalten. Diese sprechen allerdings unterschiedlich auf die Strahlentherapie an. Auf der einen Seite gibt es gut heilbare Patienten mit relativ strahlensensiblen Tumoren. Andererseits jedoch kann Patienten mit sehr strahlen-resistenten Tumoren mittels Bestrahlung meist nicht geholfen werden. Der strahlenresistente Phänotyp bestimmter Zellen eines Tumors ist schuld an der Erfolglosigkeit der Therapie bzw. das Nicht-Ansprechen darauf. Man nimmt an, dass das Ergebnis der Therapie hauptsächlich davon abhängt, wie hoch das Potential der Strahlung ist, Wachstum, Proliferation und Überleben ganz bestimmter Krebszellen zu kontrollieren. Diese Zellen werden Tumorstammzellen (TSZ) oder Tumor-initiierende Zellen genannt. Basierend auf experimentellen Studien geht man davon aus, dass der Anteil von TSZ am Tumorvolumen in unterschiedlichen Tumorentitäten variiert, und im Allgemeinen relativ gering ist. Laut der Tumorstammzell-Hypothese hängt die individuelle Strahlenantwort von Tumoren von TSZ ab, da diese anscheinend langsam replizierenden Zellen die Fähigkeit besitzen, Tumore (also auch Rezidive) zu initiieren, sowie - wie normale Stammzellen - die Fähigkeit, sich selbst zu erneueren und die heterogenen Abstam-mungslinien eines Tumors zu generieren. In der Strahlentherapie spielt neben der Existenz von TSZ auch die strahlenindu-zierte Aktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seinen downstream Signalkaskaden, wie z.B. dem Phosphoinositid-3 Kinase (PI3K)/Akt Signalweg, dem mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalweg und dem JAK/STAT Signalweg eine wichtige Rolle. Hierbei ist der PI3K/Akt Signalweg zentral für das Überleben von Tumorzellen nach Bestrahlung. Die Aktivierung von Akt führt zur Aktivierung der katalytischen Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PKcs). Dieses Enzym ist maßgeblich an der Reparatur von strahleninduzierten DNA-Doppelstrangbrüchen durch das Nicht-homologe end joining (NHEJ) beteiligt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von TSZ für die Strahlenresistenz radioselektierter Klone von nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomzellen (NSCLC) und Brustkrebszellen zu untersuchen. Des Weiteren sollte die Beteiligung des EGFR-abhängigen PI3K/Akt/DNA-PKcs Signalings an möglicherweise TSZ-vermittelter Strahlenresistenz beleuchtet werden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) Es konnten strahlenresistente Tumorzellpopulationen der Linien A549 (NSCLC) und SK-BR-3 (Brustkrebs) mittels eines Radioselektionsprozesses in vitro isoliert werden. 2) Radioselektierte Zellen zeigten eine verlängerte Verdopplungszeit sowie eine verringerte Koloniebildungseffizienz, was wahrscheinlich der Biologie von TSZ entspricht. 3) Von den untersuchten potentiellen TSZ-Markern CD133, Oct-4, Sox2 und Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH) war einzig die Expression des embryo-nalen Stammzellmarkers Oct-4 in den radioselektierten Brustkrebszellen SK-BR-3 erhöht. Für A549 Zellen konnte jedoch gezeigt werden, dass eine erhöhte Aktivität der ALDH, nicht aber eine veränderte Proteinexpression, in Zusammenhang mit Strahlenresistenz steht. 4) Weiterhin konnte in Bezug auf diese Strahlenresistenz ein Zusammenhang zwischen ALDH-Aktivität und PI3K-Signalweg hergestellt werden. 5) Mittels siRNA konnte eine gegensätzliche Wirkung von ALDH1 und ALDH2 auf das Überleben von Tumorzellen nach Bestrahlung gezeigt werden. Während die ALDH1-Expression einen Vorteil für die untersuchten Zellen darstellte, bedeutete die ALDH2-Expression hier einen Nachteil. 6) Die Strahlenresistenz der radioselektierten A549 Zellen wurde teilweise durch eine EGFR/PI3K/DNA-PKcs-abhängige DNA-Doppelstrangbruch-reparatur vermittelt. Aufgrund der in dieser Studie erzielten Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass das gezielte Targeting des PI3K/Akt Signalwegs und der ALDH1 wichtige Vorgehensweisen in der Überwindung TSZ-vermittelter Resistenz von Tumoren während der Strahlentherapie darstellen könnten.