Interactions between non-symbiotic N2-fixing bacteria and plant roots in plant-microbial associations

Abstract

The development of biofertilizers on the basis of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) may be a promising approach to partially substitute costly and energy-consuming mineral fertilizers in agricultural plant production and to support agriculture in developing countries. A successful and competitive rhizosphere colonization of PGPR strains has been identified as a prerequisite for the expression of plant growth promoting effects. Apart from a wide range of external factors with an impact on the colonization process, such as soil properties, temperature, soil moisture and fertilization levels, in particular plant-microbial interactions may play an important role for the successful establishment of compatible associations. In this context, certain plant root exudates may act as signals to mediate bacterial responses with importance for root colonisation (e.g. motility and chemotaxis, production of extracellular polysaccharides). On the other hand, the induction of bacterial plant growth promotion may also depend on ability of the host plant to respond to the presence and the activity of the associated bacteria. It was therefore the aim of this thesis to investigate the contribution of putative PGPR to growth and N uptake in wheat plants and characterize the underlying mechanisms in root-bacterial associations. In the first part of this thesis, the contribution of various non-symbiotic diazotrophic rhizobacteria to plant growth promotion and N nutrition has been studied in a series of greenhouse pot inoculation experiments with wheat (Triticum aestivum L.). Different bacterial inoculants, plant genotypes, soil properties, water regimes and N fertilization levels have been varied as factors with potential impact on plant growth promotion by diazotrophs. The contribution of biological nitrogen fixation was assessed by the 15N dilution method. Plant growth and grain yield were influenced by the different N fertilization levels but no stimulation of growth or N uptake was note upon bacterial inoculation. These observations suggested a high degree of specificity or limiting factors, determining a successful plant-microbial association. The second part describes possible mechanisms that may be involved in the establishment of diazotrophs in the rhizosphere of suitable host plants. As an initial step of the colonization process, a targeted movement of the bacteria to the root surface is required and root exudates may act as attractants. Since dicarboxylic acids are known to exert chemotactic activity on diazotrophic bacteria, seed and root exudates of two graminaceous crops (Triticum aestivum L. and Zea mays L.) and for comparison also of a non-graminaceous plant species (Phaseolus vulgaris L.) were collected in hydroponic culture with and without N supply, and organic acid profiles in these root exudates were analysed. Bacterial motility assays were conducted with the major carboxylates detected in the root exudates of the selected plant species and compared to glucose and water, using Brevibacillus reuszeri as a model bacterium. Pure malate, which was found at high levels in root exudates of bean and wheat, and particularly malonate (bean) and t-aconitate (maize) stimulated the motility of Brevibacillus reuszeri as compared with glucose or water. A particularly intense promotion of bacterial motility was recorded in the presence of crude root exudates of wheat and maize plants grown under N limitation, which was not observed for root exudates of bean. However, this was not related with comparable changes of malate or t-aconitate concentrations in the root exudates. In wheat exudates, malate concentrations even decreased in response to N limitation. These findings suggest the presence of specific factors released in root exudates of N-deficient cereals, promoting the rhizosphere colonisation with B. reuszeri. For an identification of the respective factors, a more comprehensive profiling of the root exudates is necessary. In associations with diazotrophic bacteria, host plants are supplied with ammonium by the bacterial partner. This raised the question whether plant ammonium uptake systems have an impact on the efficiency of the association. To address this problem, an antisense approach was conducted with tomato, with characterised ammonium transporters (LeAMT1;1 and LeAMT1;2). The final goal was the inhibition of the ammonium transporters by production of LeAMT antisense lines to study their putative role in plant associations with diazotrophic bacteria. Northern blot analysis revealed a strong repression of LeAMT1;2 expression in three independent antisense lines associated with a lower ammonium uptake capacity under N-sufficient and N-deficient growth conditions. In contrast, LeAMT1,1 expression was only weakly repressed in antisense lines and there was no impact on N uptake. A faster decline of chlorophyll in older leaves indicates a physiological function of LeAMT1;1 and LeAMT1;2 in ammonium uptake and retrieval in shoot and root cells. The absence of consistent effects on N acquisition of the investigated antisense lines limited the suitability of this approach for studies on associations with diazotrophic bacteria.

Die Entwicklung geeigneter Biofertilizer auf der Basis pflanzenwachstums-stimulierender Bakterien (PGPRs) könnte sowohl aus finanzieller Perspektive als auch für die Anwendung in Entwicklungsländern einen vielversprechenden Ansatz darstellen, um Kostenintensive Mineraldünger in der landwirtschaftlichen Pflanzenproduktion einzusparen. Dabei stellt eine erfolgreiche und kompetitive Besiedelung der Rhizosphäre durch PGPRs eine Voraussetzung für wachstumsfördernde Effekte auf Pflanzen dar. Obwohl der Besiedelungsprozess durch zahlreiche externe Faktoren, wie Bodeneigenschaften, Temperatur, Bodenfeuchte und Düngungsniveau beeinflusst werden kann, könnten auch selektive Wechselwirkungen zwischen Wirtspflanze und dem Bakterium eine entscheidende Rolle für das Zustandekommen kompatibler Assoziationen spielen. Hierbei könnten pflanzliche Wurzelabscheidungen eine Signalwirkung auf bakterielle Reaktionen, wie Beweglichkeit, Chemotaxis oder die Produktion von Exopolysacchariden ausüben, die für die Besiedelung der Rhizosphäre von Bedeutung sind. Andererseits könnte auch die Fähigkeit der Wirtspflanze, auf die Gegenwart der besiedelnden Bakterien zu reagieren, eine wichtige Rolle spielen. Es war das Ziel dieser Arbeit den Beitrag von PGPR auf das Wachstum und die N-Aufnahme von Weizenpflanzen zu unterscheiden und dafür verantwortliche Mechanismen in Wurzel-Bakterie-Assoziationen zu charakterisieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde in Gewächshausversuchen mit Weizen (Triticum aestivum L.) der Beitrag assoziativer diazotropher Bakterien zur Wachstumsstimulierung und N-Aufnahme von Weizenpflanzen untersucht. Verschiedene Bakterienstämme, Weizengenotypen, Bodeneigenschaften, Bewässerungsregimes und N-Düngungsniveaus wurden als externe Faktoren mit potenziellem Einfluss auf die Stimulierung des Pflanzenwachstums durch Diazotrophe untersucht. Der Beitrag der biologischen Stickstoff-Fixierung wurde mit der 15N-Verdünnungsmethode bestimmt. Das Pflanzenwachstum, der Kornertrag und die Ertragsarchitektur wurden durch die verschiedenen N-Düngungsniveaus beeinflusst, doch es zeigten sich keine Behandlungsunterschiede in Varianten mit oder ohne bakterielle Inokulation. Dies weist auf einen hohen Grad an Spezifität bislang unbekannter Faktoren hin, die für das Zustandekommen erfolgreicher bakterieller Assoziationen mit der Wirtspflanze verantwortlich sind. Im zweiten Teil der Arbeit werden mögliche Mechanismen beschrieben, die eine Besiedelung der Rhizosphäre kompatiblen Wirtspflanzen durch Diazotrophe beteiligt sein könnten. Erster Schritt des Besiedelungsprozesses ist eine gerichtete Bewegung der Bakterien zur Wurzeloberfläche. Dabei können Wurzelexsudate als Signalsubstanzen fungieren. Insbesondere Dicarbonsäuren haben eine chemotaktische Aktivität auf Diazotrophe. Deshalb wurden Samen-, und Wurzelexsudate von zwei Gramineen (Triticum aestivum L., Zea mays L.) und zum Vergleich auch von einer dikotylen Pflanzenart (Phaseolus vulgaris L.) gewonnen, die in Nährlösungskultur mit und ohne Stickstoffangebot kultiviert wurden. In den Exsudaten wurden organische Säuren bestimmt. Die chemotaktische Wirkung auf Brevibacillus reuszeri als Modell-Bakterium wurde für die dominierenden Carboxylate in den Wurzelexsudaten der untersuchten Pflanzenarten im Vergleich zu Glucose und Wasser untersucht. Malat, das in hoher Konzentration in Wurzelexsudaten von Bohne und Weizen gefunden wurde, und besonders Malonat (Bohne) und t-Aconitat (Mais) förderten die Beweglichkeit von B. reuszeri im Vergleich zu Glucose und Wasser. Eine besonders intensive Förderung der bakteriellen Beweglichkeit wurde in Gegenwart einer Gesamtfraktion von Wurzelexsudaten von Weizen und Maispflanzen beobachtet, die unter N-Mangelbedingungen angezogen wurden. Dies galt jedoch nicht für die Wurzelexsudate der Bohne und war auch nicht mit entsprechenden Veränderungen der Konzentrationen von Malat und t-Aconitat verbunden. In den Wurzelexsudaten von Weizen nahm die Konzentration von Malat unter N-Mangel sogar ab. Eine genauere Charakterisierung der betreffenden Faktoren erfordert eine umfassendere Analyse der Exsudatzusammensetzung. In Assoziationen mit diazotrophen Bakterien werden die Wirtspflanzen mit Ammonium versorgt. Dies wirft die Frage auf, ob auch pflanzliche NH4+-Aufnahmesysteme einen Einfluss auf die Effizienz der Assoziation haben. Daher wurde ein Antisenseansatz mit Tomate, die ein charakterisiertes Ammoniumaufnahmesysteme (LeAMT1;1 und LeAMT1;2) hat, durchgeführt. Ziel war es, die NH4+-Aufnahme durch Herstellung von Antisenselinien zu hemmen, um so die mögliche Bedeutung für Assoziationen mit diazotrophen Bakterien zu untersuchen. Northern-Blot Analysen ergaben eine starke Repression der Expression von LeAMT1;2 in drei unabhängigen Antisenselinien, die mit einer verminderten NH4+-Aufnahmekapazität sowohl unter N-Mangelbedingungen als auch bei ausreichender Stickstoffversorgung verbunden war. Im Gegensatz dazu zeigten LeAMT1,1-Antisenselinien nur eine leicht verminderte LeAMT1,1-Expression und keinen Effekt auf die NH4+-Aufnahme. Eine beschleunigter Chlorophyllabbau in älteren Blättern weist auf eine physiologische Funktion von LeAMT1,1 and LeAMT1;2 bei der Aufnahme und Rückverlagerung von Ammonium in Sprosszellen hin. Das Fehlen konsistenter Effekte des gewählten Antisenseansatzes auf die N-Aneignung machte daher dessen Einsatz für die ursprünglich geplanten Untersuchungen für Assoziationen zwischen Wurzeln und diazotrophen Bakterien ungeeignet.