Beiträge zur Verbesserung der Analytik von Mutationen im Protoonkogen Kirsten-ras und epigenetische Untersuchungen zur Eignung von DUSP9/MKP4 als CIMP-Marker

Abstract

The present study extends over two different fields of applications, which contribute to improvements for the analysis of colorectal cancers. First, a ligase-based method was developed which allows a quick, inexpensive, specific and highly sensitive detection of point mutations in the mutation hot spot codon12 and codon13 of the K-ras gene. The establishment and validation of the technique was performed on clinical samples, which were present as FFPE tissues and gone through routine diagnostics using conventional molecular biological techniques (microarray analysis, Sanger Sequencing) to determine the K-ras mutation status. In addition, a comparison between the new developed technology and the conventional technologies should be performed. The evaluation of the gLCR approach was done by ABI310er capillary electrophoresis. Among the tested LCR variants the gLCR-monoplex had been the most robust, specific and sensitive technique. The presence of very weak mutations in the samples had been successfully confirmed by gLCR-monoplex, whereas several conventional techniques had to be applied together to detect the mutations unambiguously. The signal strengths for all tested samples were high, coming along with a low standard deviation. The superiority of gLCR-monoplex over the conventional techniques had been further highlighted impressively by performing a comparison of methods on a dilution series. While the mutation detection using Sanger Sequencing or microarray analysis had been successful only up to the 1:10-dilution, or 1:100-dilution, it was possible to detect the K-ras mutation by gLCR-technique up to the 1:1 million-dilution. In routine diagnostics a single monoplex reaction for each possible mutation has to be performed. Therefore the monoplex technique is only suitable as a confirmatory test of weak or doubtful mutation screening results, which had been previously indicated by conventional techniques. A multiplex approach would be desirable to use the gLCR technology as a main detection technique in routine diagnostics. Therefore a single discriminating base at the mutation-specific and color-labeled oligo probe appears to be insufficient. In future studies an additional mismatch should be integrated at position (-3), in relation to the 3'-end of the dye-labeled and mutation-specific oligo probe. In this way it could come to a significant reduction of false-positive signals, thereby gLCR technology could possibly be used as a multiplex approach.

In the second part of the work the methylation status of the DUSP9/MKP4 promoter region had been evaluated. By methylation, the accessibility of the promoter, and thus the transcriptional activation of a gene can be reduced. The promoter regions of tumor suppressors are frequently strong methylated in colorectal cancer (CRC). The methylation is resulting in an increased tumorigenesis and cannot be observed in the corresponding normal tissues. This alteration is called CIMP (CpG-island-methylator-phenotype) and is an independent tumor phenotype, which is linked to other clinical aspects. Involved genes are classified as CIMP markers. The DUSP9/MKP4 gene product is a potent tumor suppressor, but it´s suitability as a marker for CIMP in CRC has not been studied so far. In this study, the degree of methylation of 79 colorectal cancer FFPE tissue samples and 22 corresponding normal FFPE tissues was determined quantitatively. A broad variation of methylation strength has been observed in the examined tumor tissues, ranging from nearly unmethylated to nearly completely methylated. Only minor differences between tumor and normal tissues had been detected for the 11 DNA samples with the lowest methylation strength. On the other side, there was a significant correlation with CRC for the 11 strongest methylated DNA samples. About 80% of the DNA from normal tissue showed clearly weaker methylation, leading to the conclusion, that an aberrant DNA methylation status is present in these tumor tissues. Additionally, 9 out of 11 strong methylated DNA samples showed CIMP criteria, which were completely missing at the weakly methylated DNA samples. This work represents, as far as published, the first study that reveals a difference in the methylation pattern of the DUSP9/MKP4 promoter from human colorectal carcinoma and their corresponding normal tissues. Strong methylation could be associated with all tested CIMP criteria. This relationship needs to be confirmed in further studies on a larger sample collective. In addition, the investigations should include the detection of microsatellite instabilities, as an additional CIMP-criterion, and a functional protein detection method should be established.

Die vorliegende Arbeit erstreckt sich über zwei verschiedene Anwendungsfelder, die Beiträge zur Verbesserung der Analytik des kolorektalen Karzinoms liefern sollen. Zunächst wurde eine Ligase-basierte Methode entwickelt, die einen schnellen, kostengünstigen, spezifischen und hochsensitiven Nachweis von Punktmutationen am K-ras-Mutations-Hot-Spot Codon12 und Codon13 ermöglicht. Die Etablierung und Validierung der Technik erfolgte an Patientenmaterial, welches als FFPE-Gewebe vorlag und für das zuvor bereits über konventionelle molekularbiologische Techniken der K-ras-Mutationsstatus ermittelt werden konnte. Zudem sollte ein Methodenvergleich zwischen der entwickelten Technik und den konventionellen Techniken erfolgen. Die Auswertung der gLCR-Ansätze geschah jeweils kapillarelektrophoretisch über die ABI310er-Plattform. Unter den getesteten LCR-Varianten stellte sich die gLCR-Monoplex als robusteste, spezifischste und sensitivste Technik heraus. Das Vorhandensein sehr schwacher Mutationen in Patientenproben, für deren zweifelsfreien Nachweis in den Routineuntersuchungen mehrere konventionelle Techniken eingesetzt werden mußten, gelang mit dieser Technik auf Anhieb. Die einzelnen Signalstärken waren für alle Proben sehr hoch, bei gleichzeitig niedriger Standardabweichung. Über den Methodenvergleich an einer Verdünnungsreihe konnte die Überlegenheit des gLCR-Prinzips gegenüber den konventionellen Techniken weiter herausgestellt werden. Während der Mutationsnachweis mittels Sanger-Sequenzierung oder Mikroarray-Analyse nur bis zur 1:10-, bzw. 1:100-Verdünnung gelang, konnten unter Anwendung der gLCR-Technik spezifische Signale bis zur 1:1 Mio-Verdünnung detektiert werden. Im Routinebetrieb müßte jedoch für jede Mutation eine separate Monoplex-Reaktion durchgeführt werden. Die Monoplex-Technik eignet sich daher nur als Bestätigungstest von schwachen oder zweifelhaften Resultaten, die zuvor über konventionelle Techniken ermittelt wurden. Ein Multiplex-Ansatz wäre wünschenswert, um die Technik auch als Hauptnachweistechnik in der Routinediagnostik einsetzen zu können. Dafür scheint eine diskriminierende Base an den Oligosonden jedoch nicht ausreichend zu sein. In zukünftigen Studien sollte daher ein zusätzlicher Mismatch an der Position (-3), bezogen auf das 3´-Ende der mutationsspezifischen Oligosonde, integriert werden. Auf diese Weise käme es zu einer deutlichen Reduktion der falsch-positiven Signale, wodurch die gLCR-Technik möglicherweise auch als Multiplex-Ansatz einzusetzen wäre.

Im zweiten Aufgabenfeld wurde der Methylierungsstatus der DUSP9/MKP4-Promotorregion untersucht. Durch Methylierung kann die Zugänglichkeit des Promotors, und damit die transkriptionelle Aktivierung eines Gens stark reduziert werden. Beim kolorektalen Karzinom (CRC) kommt es im Tumorgewebe häufig zu einer verstärkten Methylierung der Promotorregion von Tumorsuppressoren, welche mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wird und im korrespondierenden Normalgewebe nicht zu beobachten ist. Man spricht in diesem Fall von CIMP (CpG-island-methylator-phenotype), welcher einen eigenständigen Tumorphänotyp darstellt und mit weiteren klinischen Aspekten verknüpft ist. Beteiligte Gene werden als CIMP-Marker klassifiziert. Das DUSP9/MKP4-Genprodukt wird als starker Tumorsuppressor dargestellt, ohne dass dessen Eignung als CIMP-Marker beim CRC bisher untersucht worden wäre. In dieser Studie wurde der Methylierungsgrad der DUSP9/MKP4-Promotorregion an 79 kolorektalen FFPE-Karzinomgeweben und 22 korrespondierenden Normalgeweben quantitativ bestimmt. In der DNA der Tumorgewebe kam es zu einer breiten Fächerung der Methylierungsstärke von annähernd unmethyliert bis annähernd komplett und stark methyliert. Für die 11 am schwächsten methylierten Proben finden sich nur geringe Unterschiede zwischen der Methylierungsstärke von Tumor- und korrespondierenden Normalgeweben. Dem gegenüber wurde bei den 11 Proben mit der stärksten Methylierung eine starke Korrelation mit CRC beobachtet, da in über 80% der Fälle im korrespondierenden Normalgewebe die DNA deutlich schwächer methyliert vorlag. Es kommt somit in diesen Tumorgeweben zu einer aberranten DNA-Methylierung. Desweiteren lagen für die stark methylierten DNA-Extrakte in 9 von 11 Fällen CIMP-Kriterien vor, die bei keinem der 11 schwach methylierten DNA-Extrakte aufzufinden waren. Diese Arbeit stellt, soweit veröffentlicht, die erste wissenschaftliche Studie dar, in der eine unterschiedliche Methylierung des humanen DUSP9/MKP4-Promotors zwischen kolorektalen Karzinom- und korrespondierenden Normalgeweben aufgedeckt und ein Zusammenhang mit den CIMP-Kriterien hergestellt werden konnte. Dieser Zusammenhang müßte jedoch in weiteren Studien an einem größeren Probenkollektiv bestätigt werden. Zudem sollten Untersuchungen zum Nachweis von Mikrosatelliteninstabilitäten als weiteres CIMP-Kriterium in die Untersuchungen mit aufgenommen und eine funktionstüchtige Proteinnachweismethode etabliert werden.