Entwicklung von „screening“-Methoden zur Analyse von PTGS-basierter Resistenz gegen Nepoviren in Pflanzen

Abstract

Nepoviruses are the causal agent of the fanleaf disease which leads to severe loss in viticulture (Raski et al., 1983). To induce virus resistance by post transcriptional gene silencing (PTGS) against Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV) and Raspberry ringspot virus (RpRSV), grapevine rootstocks were transformed with inverted repeat constructs or constructs containing sequences of the target virus and the defective interfering (DI) sequence of Tomato bushy stunt virus (Reustle et al., 2005). The induction und efficiency of PTGS by different constructs were investigated on the model plant Nicotiana benthamiana. Transgene-induced PTGS was demonstrated by the detection of small interfering (si)RNA in N. benthamiana. Using Agrobacterium for infiltration of a GFP-sensor construct, consisting of the GFP expression cassette and the sequence of the target virus, the efficiency of established transgene-induced PTGS was investigated. GFP-expressing plants accumulated mRNA of the sensor construct after the first day post infiltration in infiltrated leaves. After the second day the accumulation of siRNA with GFP- und virus-specific sequences was detected. In plants, which did not show any GFP-fluorescence after infiltration, GFP or viral sequence specific siRNA were not detectable. Generally, in virus resistant plants GFP-fluorescence was absent after infiltration. A correlation of virus resistance und accumulation of virus- or transgene-specific siRNA was not found. Several systems to evaluate PTGS and virus resistance in transgenic grapevine were tested. Transgenic grapevine did not accumulate transgene specific siRNA. An elevated resistance of transgenic grapevine was discovered by grafting experiments onto virus infected rootstocks. Whereas virus infected grapevine accumulated virus- and transgene-specific RNA and siRNA, in the non-infected grafts viral RNA was not detectable. Obviously, degradation of viral RNA in resistant grapevine und N. benthamiana was rapid und highly efficient without leading to accumulation of siRNA. However, due to the high inoculum pressure, grafting experiments are difficult to interprete and a possible field resistance against natural infection by the vector nematodes is probably not detectable. For investigation of PTGS in transgenic grapevine in vivo a system for vacuum infiltration to transfer the GFP-sensor construct into leaf tissue was established. For inoculation of grapevine using the natural GFLV vector nematode Xiphinema index an in vitro dual culture was developed. This space saving system allows analysis of resistance of grapevine under controlled conditions within a short time. An incubation time of about only six weeks was sufficient for the inoculation of control plants.

Die durch Nepoviren verursachte Reisigkrankheit führt zu beträchtlichen Einbußen im Weinbau (Raski et al., 1983). Um Resistenz durch ?post transcriptional gene silencing? (PTGS) gegen die Nepoviren Grapevine fanleaf virus (GFLV), Arabis mosaic virus (ArMV) und Raspberry ringspot virus (RpRSV) zu induzieren, wurden Reben mit ?inverted repeat?-Konstrukten bzw. mit Konstrukten transformiert, die ?defective interfering?-Sequenzen aus Tomato bushy stunt virus (TBSV) in Kombination mit konservierten viralen Sequenzen des Zielviruses enthielten (Reustle et al., 2005). Die Induktion und Effizienz von PTGS durch die verschiedenen Konstrukte wurde an der Modellpflanze Nicotiana benthamiana untersucht. PTGS konnte über die Akkumulation von transgenspezifischer ?small interfering? (si)RNA in N. benthamiana nachgewiesen werden. Durch Agrobakterien-Infiltration eines GFP-Sensorkonstrukts wurde die Effizienz von etabliertem PTGS in transgenen N. benthamiana überprüft. GFP-exprimierende Pflanzen akkumulierten in den infiltrierten Blättern am ersten Tag nach der Infiltration mRNA des Infiltrats. Ab dem zweiten Tag nach der Infiltration wurde siRNA mit GFP- und virusspezifischer Sequenz detektiert. In Pflanzen, die keine GFP-Fluoreszenz zeigten, war weder mRNA, noch siRNA des infiltrierten Sensorkonstrukts nachweisbar. Bei virusresistenten Pflanzen konnte in der Regel keine GFP-Fluoreszenz nach der Agrobakterien-Infiltration festgestellt werden. Eine Korrelation von Virusresistenz mit der Akkumulation von viraler oder transgenspezifischer siRNA lag nicht vor. Verschiedene Systeme zur Evaluierung von PTGS und Virusresistenz in Reben wurden überprüft. Eine Akkumulation von siRNA, die auf transgen-induziertes PTGS hinweist, konnte bei Reben nicht festgestellt werden. Durch Virusinokulation mittels Pfropfung der transgenen Reben auf virusinfizierte Unterlagen konnte zumindest eine verminderte Virusanfälligkeit einer transgenen Linie festgestellt werden. Virusinfizierte transgene Reben und nicht-transgene Kontrollreben akkumulierten sowohl virale RNA, als auch siRNA. In transgenen Reben, die keine Virusinfektion zeigten, war weder virale RNA, noch siRNA zu detektieren. Eine etablierte Virusresistenz durch transgen-induziertes PTGS in transgenen N. benthamiana korrelierte nicht mit der Akkumulation von siRNA. Resistenzanalysen über Inokulation durch Pfropfung sind schwierig zu interpretieren, da durch den hohen Infektionsdruck eine eventuell vorhandene Feldresistenz nicht festgestellt werden kann. Um PTGS an Rebenblättern in vivo zu überprüfen, wurde eine Methode zur Agrobakterien-Infiltration durch Vakuum etabliert. Zur Virusinokulation durch Vektornematoden von Reben stehen sehr aufwändige und langwierige Freiland- bzw. Gewächshausversuche zur Verfügung. Eine in vitro Dualkultur wurde zur Inokulation mit Xiphinema index, dem natürlichen Vektor für GFLV, entwickelt. Mit diesem Inokulationssystem ist es möglich, die Resistenz von Reben unter kontrollierten Bedingungen auf kleinem Raum innerhalb kurzer Zeit zu testen. Bei Kontrollreben wurde eine Virusinfektion schon nach sechs Wochen Inkubationszeit nachgewiesen.