Establishment of reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for the detection of newly described RNA viruses in reptiles : picornaviruses in tortoises, reptarenaviruses in snakes, and sunshinevirus in snakes

Abstract

The purpose of this study was to establish conventional reverse-transcriptase PCRs for the detection of recently described RNA viruses in reptiles. The viruses studied included picornaviruses of tortoises (torchivirus or virus “X”), reptarenaviruses and sunviruses in snakes. Picornaviruses are detected frequently in tortoises of various species in Europe. Until recently, tortoise picornaviruses (previously designated as virus “X”) could only be detected by isolation in Terrapene heart (TH1) cells in which they cause cell lysis, and nothing was known about the relationships of various isolates to one another. Clinical signs that have been described in picornavirus infected tortoises include softening of the shell in juvenile tortoises, rhinitis, conjunctivitis, kidney failure, and sudden death, but these viruses have also been detected in clinically healthy animals. This group of picornaviruses is able to infect a wide range of species in the family Testudinidae and has been detected in tortoises in many different European countries. In this study, a conventional RT-PCR was developed and established for the detection and identification of picornaviruses in clinical samples. To test the reliability of this RT-PCR as a diagnostic method and the several primer sets which were designed for this purpose (Table 4.7), 37 picornaviruses isolated from swabs and tissue samples collected in Germany and Italy between 1997 and 2012 were screened. The primer pair FKei2 (CTACCATCAGGATGCAGTT) - RKei2 (AAGCCAATCCTGCAACACT) gave the highest number of positive results from the chosen isolates (70%). 308 nucleotide long sequences of the amplified products of 26 picornavirus isolates were obtained which represent a small part of the viral polyprotein gene. Alignment of the obtained sequences from the amplified products revealed a close genetic relationship among the detected tortoise picornavirus isolates confirmed by the high identity values between 79.2 – 100% (Table 11.3 in appendix). Phylogenetic analysis clearly shows two main clusters, which together form a single monophyletic cluster. The obtained viral sequences of the polyprotein gene were compared with previously described picornaviruses and the highest similarities were observed with the corresponding gene sequences of picornavirus family members including: Canine picornavirus, Human enterovirus 109, Human rhinovirus C, and Human coxsackievirus A13. Based on sequence analysis, no association was observed between the geographic distribution and genetic relatedness. BLASTn analysis of the sequences confirmed that each of the PCRs with the different primer sets was specific. Furthermore, no strict host specificity was indicated. The PCR-based diagnosis may provide a time-saving and sensitive method to detect tortoise picornaviruses and to help prevent viral spread among animal collections. A conventional RT-PCR was also established for the detection of arenaviruses in snakes and used to screen clinical samples from live and dead animals for these viruses. The reptarenaviruses are considered to be the causative agent of inclusion body disease (IBD) which is a chronic progressive disease affecting captive boas and pythons worldwide. Samples from animals screened for virus detection were also screened for the presence of IBD typical inclusions in blood smears or histological preparations of 63 organs. The primer combinations MDS-400 (5’-TTCATTTCTTCATGRACTTTRTCAATC-3’) and MDS-402 (5’-GGSATAACAAAYTCACTTCAAATATC-3’) targeting part of the glycoprotein gene were used for the detection of reptarenavirus. 49 of 170 snakes tested (28.8%) were arenavirus positive. While 17 of 20 IBD positive snakes (85%) were arenavirus positive by RT-PCR, 17 of 43 IBD negative animals (39.5%) were arenavirus positive. Arenavirus was found in both boas (Boa constrictor) and pythons (Python regius, Malayopython reticulatus, Python molurus, and Morelia viridis). Alignment of the obtained sequences of a small portion of the glycoprotein gene from the detected arenaviruses showed high identity values between 71- 100% with previously described reptarenaviruses. Phylogenetic analysis indicated that a majority of the detected reptarenavirus strains clearly clustered with GGV, Boa AV NL B3 and UHV. None of the detected viruses clustered with CASV. Furthermore, this work includes a study concerning the first detection of sunshinevirus in snakes in Europe using RT-PCR as a diagnostic method. The first description of sunshinevirus was in 2008 after an outbreak of neuro-respiratory disease in an Australian collection of 70 pythons. The RT-PCR used in this study resulted in the detection of sunviruses in three out of 12 snakes tested (25%). The obtained sequences were compared with the corresponding portion of the sunshinevirus genome and the identity values were between 95- 98 %. The viruses were found in oral/ cloacal swabs, lung lavage and skin sample of ball pythons, all other tested snakes were negative (two boas, one anaconda and one Indian python). Clinical signs reported in the animals infected with sunshinevirus vary significantly, but mostly respiratory problems were reported.

Ziel der vorliegenden Arbeit war Etablierung von konventionellen Reverse-Transkriptase-PCRs für den Nachweis von den bisher bekanten RNA-Viren in Reptilien. Zu den untersuchten Viren gehörten Picornaviren in Schildkröten (Torchiviren oder virus "X"), Reptarenaviren und Sunviren in Schlangen. Picornaviren wurden bisher bei verschiedenen Schildkrötenspezies nachgewiesen im Europa am häufigsten werden sie bei Testudinidae gefunden. Bis vor kurzem, Picornaviren aus verschiedenen Proben von Landschildkröten wurde nur auf die Zelllinie Terrapene Heart cells (TH1) nachweisen und isoliert, dabei einen lytischen zytopathischen Effekt verursacht und nichts war bekannt über die Beziehung zwischen Vieren Isolaten. Zu den klinischen Zeichen gehören Panzererweichung bei Jungtieren, Rhinitis, Konjunktivitis, Nierenausfall, sowie plötzlichen Todesfällen, allerdings Picornaviren können gelegentlich auch bei scheinbaren gesunden Schildkröten nachweisen werden. In dieser Arbeit wurde eine konventionelle RT-PCR entwickelt und festgestellt für die Diagnose und Identifizierung von Piconaviren in klinischen Tierproben. 37 Picornaviren wurde isoliert vom Rachentupfer und von den verschiedenen Gewebeproben, diese wurden in Deutschland und Italien zwischen 1997 – 2012 gesammelt. Alle Isolate wurden abgeschirmt für den Zweck überprüfen die Zuverlässigkeit dieser RT-PCR als Diagnostische Methode und überprüfen die verschiedenen Primer-Sets, die zu diesem Zweck entworfen wurden (Table 4.7). Das Primer paar FKei2 (CTACCATCAGGATGCAGTT) - RKei2 (AAGCCAATCCTGCAACACT) hat die Mehrheit (70%) von der positiven Ergebnisse aus den ausgewählten Isolaten vorgelegt. Von 26 Picornaviren Isolaten Nukleotidsequenzen der amplifizierten Produkte wurde erhalten mit einer Länge von 308, und die einen kleinen Teil des viralen Polyprotein-Gens darstellen. Die Ausrichtung der erhaltenen Sequenzen aus den amplifizierten Produkten ergab eine enge genetische Beziehung zwischen den detektierten Schildkrötenpikornavirus-Isolaten, die durch die hohen Identitätswerte zwischen 79,2 und 100% (Table 11.3 in Appendix). Die phylogenetische Analyse zeigt deutlich zwei Hauptcluster, die zusammen einen einzigen monophyletischen Cluster bilden. Die erhaltenen viralen Sequenzen des Polyprotein-Gens wurden mit den zuvor beschriebenen Picornaviren verglichen und die höchsten Ähnlichkeiten wurden mit den entsprechenden Gensequenzen von Picornavirus-Mitgliedern beobachtet, einschließlich: Human cosavirus D. Theilers-like virus, Saffold virus, Cardiovirus, Rhinitis B virus and Mouse Mosavirus. Nach der Sequenzanalyse, es wurde keine Verbindung zwischen der geographischen Verteilung und der genetischen Verwandtschaft beobachtet. Die BLASTn-Analyse der Sequenzen bestätigte, dass jede der PCRs mit den verschiedenen Primersätzen spezifisch war. Weiterhin es wurde keine strenge Wirtstierspezifität angegeben. Die PCR-basierte Diagnose kann eine zeitsparende und empfindliche Methode zur Erkennung von Schildkröten-torchivirusinfectionen und zur Vermeidung von Virusausbreitung unter Tierkollektionen bieten. Eine konventionelle RT-PCR wurde auch für den Nachweis von Arenaviren in Schlangen etabliert und verwendet, um klinische Proben von lebenden und toten Tieren für diese Viren zu untersuchen. Die Reptarenaviren gelten als Erreger der Inclusion Body Disease (IBD), die eine chronische bedeutende Erkrankung ist, die die Gefangenen Boas und die Pythons weltweit betrifft. Proben von Tieren, die auf Virenerkennung untersucht wurden, wurden ebenfalls auf die Anwesenheit von IBD-typischen Einschlüssen in Blutabstrichen oder histologischen Präparationen von 63 Organen untersucht. Die Primer-Kombination MDS-400 (5-TTCATTTCTTCATGRACTTTRTCAATC-3 ) und MDS-402 (5-GGSATAACAAAYTCACTTCAAATATC-3), die einen Teil des Glykoprotein-Gens ausrichten, wurden für den Nachweis von Reptarenavirus verwendet. 49 von 170 getestet Schlangen (28,8%) waren Arenavirus positiv. Während 17 von 20 IBD-positiven Schlangen (85%) waren Arenavirus positiv, waren 17 von 43 IBD-negativen Tieren (39,5%) Arenavirus positiv durch RT-PCR arenavirus. Arenaviren wurde in beiden Boas und Pythons gefunden, besonders in Python regius, Malayopython reticulatus, Python molurus und Morelia viridis. Die Ausrichtung der erhaltenen Sequenzen eines kleinen Teils des Glykoprotein-Gens aus den nachweisenden Arenaviren zeigte hohe Identitätswerte zwischen 71- 100% mit zuvor beschriebenen Reptarenaviren. Die phylogenetische Analyse zeigte, dass eine Mehrheit der detektierten Reptarenavirus-Stämme eindeutig mit GGV, Boa AV NL B3 und UHV gruppiert war. Keines der erkannten Viren mit CASV gruppiert. Weiterhin, umfasst diese Arbeit eine Studie über die erste Erkennung von Sunsheinviren in Schlangen in Europa mit RT-PCR als diagnostische Methode. Die erste Beschreibung von Sunshinevirus war im Jahr 2008 nach einem Ausbruch der Neuro-Atemwegserkrankung in einer australischen Sammlung von 70 Pythons. Die in dieser Studie verwendete RT-PCR führte zum Nachweis von Suniviren in drei von 13 getesteten Schlangen (23,1%). Die erhaltenen Sequenzen wurden mit dem entsprechenden Teil des Sunsheinvirus-Genoms verglichen und die Identitätswerte waren zwischen 95- 98%. Die Viren wurden in oralen / kloakalen Tupfern, Lungenspülung und Hautprobe von Ball python gefunden, alle anderen getestete Schlangen waren negativ (zwei Boas, eine Anaconda und eine indische Python). Klinische symptome, die bei den mit Sunshinevirus infizierten Tieren gemeldet wurden, deutlich variieren, aber meistens wurden Atemwegserkrankungen gemeldet.