Mitochondrial haplotypes, gene expression and nuclear diversity in two strains of laying hens

Abstract

The domesticated chicken (Gallus gallus domesticus) is the most popular and widely spread domestic fowl worldwide, providing human with a stable source of protein in form of meat and eggs for centuries. The ongoing growth of human population increases the need for food and made poultry production one of the fasted growing sectors in the past decades. This need for food has resulted in several different strains which outperform their wild ancestors in terms of meat and egg production. During the past decades not only animal welfare gained importance but also ecological aspects such as global warming and the shortage of resources are becoming more important to society. One important resource for mankind which is becoming shortened is phosphorus (P), whose deposits in form of rock phosphate could be exhausted within the next 50-100 years. 90% of P supply is used in agriculture as fertilizer, whose demand will increase as well with growing population. This thesis focuses on the mitochondrial genetic background and mitochondrial related gene expression in the context of the productive life span and different diets in two contrasting high-yielding strains of laying hens, Lohmann Brown-Classic (LB) and Lohmann LSL-Classic (LSL). Mitochondria, which are commonly known as the powerhouse of the cell due to their role as the main producer of energy, play roles in other processes from cellular homeostasis to the process of ageing. The process of oxidative phosphorylation depends on the availability of P and thus, they become an important part of the complex framework of P utilization. In addition, mitochondrial haplotypes are known to affect physiological traits such as body weight in laying hens or important traits such as e.g. the metabolic capacity in dairy cows. It is known, that single mutations in the mitochondrial genome lead to a better adaptation to height in the Tibetan chicken or play a role in diseases from Alzheimer to obesity or lead to resistance to disease such as Marek’s disease in birds. This work provides insight into the whole mitochondrial genome of 180 laying hens of two commercial strains and links this information to physiological traits and genetic diversity. In addition, the first large-scaled gene expression analyses in the context of the productive life span and different P and Ca contents in laying hens is implemented. The analysis of mitochondrial haplotypes revealed a low level of genetic diversity with only three haplotypes within the LB strain while all LSL hens shared the same mitochondrial genome. Following from this observation, the nuclear genome was analysed based on genotyping data to reveal the whole genetic diversity of both strains. On the nuclear genetic level, both strains appeared as clearly distinct and equally diverse, while some individuals appear as strikingly close related. These individuals are mostly half-siblings sharing the same mitochondrial haplotype, underlining the need for more analyses about the genetic structure about the parental generation, especially the maternal background. Although there were no strong associations were found between the mitochondrial haplotypes and the analysed phenotypic traits (feed intake, body weight, P and Ca utilization), the differences between the strains indicate a potential involvement of the mitochondrial genetic background. The gene expression analyses revealed tissue type and point of the productive life span as the main influencers on gene expression while the influence of the strain is secondary. In addition, the expression of the gene GAPDH, which is frequently used as a reference gene for normalization in gene expression studies, was influenced by tissue and strain, leading to the decision to exclude it as a reference, that should be considered for in further studies. Further, no influence of the changes in dietary P and Ca on gene expression could be observed, suggesting that a reduction of 20% of both minerals is possible without the need to adapt gene expression. However, the results show, that a reduction of both minerals has less effect than a reduction of P alone, leading to an imbalance. In the context of the productive live span, mitochondrial and mitochondrial regulatory genes react contrary, illustrating the complexity of mitochondrial gene expression and regulation. In addition to the higher variance in the analysed phenotypic traits and mitochondrial genome in LB hens, they showed signs of increased oxidative stress compared to LSL hens. In the context of the productive life span, a potential higher demand for energy is suggested, since OXPHOS related gene expression is increasing. As a conclusion this work provides an insight into the mitochondrial genome and provides the first large scaled analysis of mitochondrial linked gene expression in two contrasting laying hen strains.

Das Haushuhn (Gallus gallus domesticus) als bekanntestes und weltweit verbreitetste Geflügel ist seit Jahrhunderten eine beständige Proteinquelle in Form von Fleisch und Eiern. Das fortlaufende Bevölkerungswachstum und der daraus hervorgehende steigende Bedarf an Nahrung hat den Geflügelsektor zum am stärksten gewachsenen Bereich der Tierhaltung der letzten Jahrzehnte weltweit gemacht. Mit der Zeit sind so verschiedene Zuchtlinien entstanden, die auf maximale Legeleistung oder die Fleischproduktion gezüchtet wurden und ihre wilden Vorfahren in diesen Leistungen weit übertreffen. In den letzten Jahren hat nicht nur das Thema Tierwohl an Bedeutung gewonnen, sondern auch ökologische Themen wie Erderwärmung und Ressourcenknappheit sind in den Fokus der Öffentlichkeit gerückt. Eine für den Menschen wichtige Ressource ist Phosphor, dessen Vorrat in Form von Rohphosphat bereits in den nächsten 50-100 Jahren aufgebraucht sein könnte. 90% des verbrauchten Phosphors wird in der Landwirtschaft als Düngemittel benötigt, dessen Bedarf mit dem anhaltenden Bevölkerungswachstum weiter steigen wird. Diese Arbeit analysiert das mitochondrielle (mt) Genom der Tiere und verbindet diese Informationen mit Genexpressionsanalysen im Zusammenhang mit der produktiven Lebensspanne und verschiedenen Futterzusammensetzungen in zwei unterschiedlichen Hochleistungs-Legehennen-Linien. Mitochondrien sind als zelluläre Energieproduzenten gemeinhin als die Kraftwerke der Zelle bekannt, spielen zusätzlich in zahlreichen weiteren Prozessen wie beim zellulären Gleichgewicht und dem Alterungsprozess eine Rolle. Die oxidative Phosphorylierung ist abhängig von der Verfügbarkeit von Phosphor und daher wichtiger Bestandteil im Zusammenhang mit der Phosphorverwertung. Zusätzlich ist bekannt, dass mt Haplotypen physiologische Merkmale wie Körpergewicht in Legehennen oder wichtige Merkmale wie die metabolische Kapazität in Milchkühen beeinflussen. Schon einzelne Mutationen im mt Genom können einen großen Einfluss haben, wie zum Beispiel in Krankheiten wie Alzheimer oder der Resistenz gegen die Marek-Krankheit in Vögeln oder die Anpassung an Höhen im Tibetanischen Huhn. Diese Arbeit gibt Einblicke in das mt Genom von 180 Legehennen aus zwei Zuchtlinien und verbindet sie mit physiologischen Merkmalen und genetischer Diversität. Zusätzlich beinhaltet sie eine umfassende Genexpressionsanalyse in Legehennen im Kontext der produktiven Lebensspanne sowie der Phosphor und Calcium Nutzung. Die Analyse der mt Haplotypen hat eine geringe Diversität gezeigt, mit drei Haplotypen in LB Hennen während alle LSL Hennen denselben Haplotyp teilen. Aufgrund dieser Beobachtung wurde auch das Kerngenom basierend auf Genotypisierungsdaten betrachtet, um die genetische Diversität innerhalb beider Linien zu erfassen. In diesen Analysen sind beide Linien klar getrennt und ähnlich divers, während einige Tiere als nah verwandt erscheinen. Diese Tiere sind meistens Halbgeschwister die sowohl denselben Vater als auch den gleichen mt Haplotyp teilen. Dieses Ergebnis verdeutlicht die Notwendigkeit weiterer Analysen der Elterngeneration, besonders in Bezug auf die Mütter der Tiere. Obwohl es nicht möglich war die mt Haplotypen mit den analysierten phänotypischen Merkmalen (Körpergewicht, Futteraufnahme und Phosphor und Calcium Nutzung) in allen Bereichen eindeutig zu assoziieren, zeigen die Unterschiede zwischen den Linien einen möglichen Einfluss des mt Genoms. Die erste groß angelegte Genexpressionsanalyse in Legehennen in diesem Kontext hat gezeigt, dass der Gewebetyp und Zeitpunkt innerhalb der produktiven Lebensspanne den größten Einfluss auf Genexpression haben, während der Einfluss der Linie zweitrangig zu sein scheint. Zusätzlich wurde ein Einfluss von Gewebstyp und Linie auf das Gen GAPDH festgestellt, welches häufig als Referenzgen in Genexpressionsanalysen genutzt wird. Aufgrund dessen wurde es als Referenzgen ausgeschlossen, was auch für zukünftige Studien von Bedeutung ist. Des Weiteren wurde beobachtet, dass sich die verschiedenen Futterzusammensetzungen nicht auf die Genexpression auswirken, was darauf schließen lässt, dass eine 20%ige Reduktion von Phosphor und Calcium möglich ist, ohne dass die Tiere ihre Genexpression anpassen müssen. Die Ergebnisse zeigen aber auch, dass die gleichzeitige Reduktion beider Minerale einen geringeren Effekt hat, als die Reduktion nur eines der Mineralien. Im Zusammenhang mit der produktiven Lebensspanne haben die Analysen gezeigt, dass mitochondrielle und mitochondriell regulierende Gene gegensätzlich reagieren, was die Komplexität mt Genexpression und ihrer Regulierung verdeutlicht. Zusätzlich zu der höheren Varianz der phänotypischen Merkmale und der mt Diversität in LB Hennen gab es Anzeichen für erhöhten oxidativen Stress im Vergleich zu LSL Hennen. Die steigende Genexpression von Genen in Zusammenhang mit oxidativer Phosphorylierung im Verlaufe der produktiven Lebensspanne lässt auf einen höheren Energiebedarf schließen.