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Doctoral Thesis
2025
Protein interactions between the bacteriophage T4 tail tip and the inner membrane of Escherichia coli
Protein interactions between the bacteriophage T4 tail tip and the inner membrane of Escherichia coli
Abstract (English)
The infection process of bacteriophage T4 represents a fascinating series of orchestrated events, involving highly coordinated conformational changes and molecular interactions. While the initial stages, such as adsorption, host receptor recognition, and tail sheath contraction, are well-characterized (Islam et al., 2019; Leiman et al., 2004), the molecular mechanism underlying the translocation of the T4 genome across the inner host membrane remains poorly understood. The transport of the T4 DNA across bacterial membranes is particularly challenging due to its hydrophilic, polyanionic nature and the need to traverse the hydrophobic barriers of bacterial membranes. This step is critical for infection success, as it must occur without disrupting the host cell’s membrane potential or metabolic energy supply, which are essential for phage propagation. The central spike complex, comprising gp5Cβ and gp5.4, is the first component to enter the periplasm upon contraction of the T4 phage tail. This study aimed to investigate the interactions between the T4 phage tail tip proteins gp27, gp5, and gp5.4 and periplasm and inner membrane components of Escherichia coli.
The first part of this study examined the behavior of the T4 central spike complex, specifically the gp5Cβ-gp5.4 component, after penetrating the outer membrane of E. coli. The spike complex, composed of three gp5Cβ and one gp5.4 subunit, punctures the outer membrane during tail contraction and enters the periplasm. To explore potential interactions with periplasmic components, in vitro binding assays using purified gp5Cβ-gp5.4 complexes and E. coli spheroplasts were performed. Results indicated that the spike complex lacked significant affinity for membrane bilayers, consistent with its structural properties, which lack hydrophobic or amphipathic regions. Cross-linking experiments with spheroplasts revealed a transient interaction between the spike complex and the periplasmic chaperone PpiD. This interaction was confirmed using proteoliposomes reconstituted with purified PpiD, which showed enhanced binding of the spike complex compared to control liposomes. PpiD is a periplasmic chaperone anchored to the inner membrane and is known for its role in stabilizing unfolded proteins. It is hypothesized that PpiD transiently interacts with the spike complex, stabilizing it or facilitating its positioning near the inner membrane for subsequent stages of infection. The biological relevance of PpiD was assessed using an efficiency of plating (EOP) assay, which revealed a reduction in infection efficiency in PpiD deletion mutants, with plaque formation decreasing to approximately 80% of wild type levels. This suggests that while PpiD is not essential for infection, it provides a supportive role, potentially complemented by other periplasmic chaperones.
The second part of the study focused on the tail tip protein gp27 and its interactions with the inner membrane. Gp27, which forms a trimeric structure associated with gp5, is proposed to play a crucial role in forming a channel for DNA translocation. To investigate its potential binding to inner membrane proteins, T4 phage particles carrying His-tagged gp27 were constructed, and cross-linking experiments were performed in vivo. These studies identified several host proteins that interact with gp27, including DamX and PpiD. DamX, a cell division protein involved in peptidoglycan remodeling and septal ring stabilization, was identified as a key binding partner of gp27. Cross-linking and affinity purification confirmed this interaction, and subsequent infection assays demonstrated a significant reduction in T4 infection efficiency to 60% in DamX deletion mutants. These findings underscore the critical role of DamX in facilitating phage DNA translocation across the inner membrane. The study suggests that DamX may provide a structural or functional scaffold, stabilizing the phage-host interface during infection. PpiD, which was also identified in the first part of the study, was co-purified with gp27, highlighting its involvement in multiple stages of the infection process. Its role in stabilizing the phage at the inner membrane or facilitating structural rearrangements required for DNA translocation warrants further investigation. In addition to identifying these interactions, the study explored the functional implications of DamX and PpiD during infection. Complementary experiments demonstrated that both proteins are not only important for initial binding but may also be involved in facilitating the structural transitions required for successful DNA translocation.
Abstract (German)
Der Infektionsprozess des Bakteriophagen T4 ist eine komplexe Abfolge präzise koordinierter molekularer Mechanismen, die durch Konformationsänderungen und spezifischen Interaktionen zwischen viralen und bakteriellen Komponenten gekennzeichnet ist. Während die frühen Stadien der Infektion, wie die Adsorption, die Erkennung von Wirtsrezeptoren und die Kontraktion der Schwanzhülle, umfassend untersucht wurden (Islam et al., 2019; Leiman et al., 2004), sind die Mechanismen, die die Translokation des T4-Genoms durch die innere Wirtsmembran vermitteln, bislang kaum verstanden. Die Herausforderung dieses Prozesses liegt in der hydrophilen, polyanionischen Beschaffenheit der DNA und der Notwendigkeit, hydrophobe bakterielle Membranen zu durchdringen, ohne dabei das Membranpotential oder die metabolische Energieversorgung der Wirtszelle zu beeinträchtigen, um eine Phagenvermehrung zu gewährleisten. Der zentrale Spike-Komplex ist die erste Struktur, die nach der Schwanzkontraktion in das Periplasma des Wirts eindringt. Ziel dieser Studie war es, die Interaktionen zwischen den Schwanzspitzenproteinen gp27, gp5 und gp5.4 sowie periplasmatischen und inneren Membrankomponenten von Escherichia coli zu charakterisieren.
Im ersten Teil der Studie wurde das Verhalten des zentralen Spike-Komplexes von T4, bestehend aus dem gp5Cβ-gp5.4 Teil, nach dessen Durchdringen der äußeren Membran von E. coli analysiert. Dieser Spike-Komplex, gebildet aus drei gp5Cβ- und einer gp5.4-Untereinheit, perforiert während der Schwanzkontraktion die äußere Membran und tritt in den periplasmatischen Raum ein. Um potenzielle Interaktionen mit periplasmatischen Komponenten zu untersuchen, wurden in vitro Bindungsstudien mit gereinigten gp5Cβ-gp5.4-Komplexen und E. coli-Spheroplasten durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass der Spike-Komplex keine signifikante Affinität zu Lipid-Doppelschichten aufweist, was mit seinen strukturellen Eigenschaften konsistent ist, da keine hydrophoben oder amphipathischen Regionen vorliegen. Cross-linking Experimente mit Spheroplasten identifizierten jedoch eine Interaktion des Spike-Komplexes mit dem periplasmatischen Chaperon PpiD. Diese Interaktion wurde durch Experimente mit Proteoliposomen, die mit gereinigtem PpiD rekonstituiert wurden, bestätigt. Dabei wurde eine erhöhte Bindung des Spike-Komplexes im Vergleich zu Liposomen festgestellt. PpiD ist an der inneren Membran verankert und für die Stabilisierung ungefalteter Proteine bekannt. Es könnte vorübergehend mit dem Spike-Komplex interagieren, um diesen zu stabilisieren oder in die Nähe der inneren Membran zu positionieren, wodurch die nachfolgenden Infektionsstadien erleichtert werden. Die funktionelle Bedeutung von PpiD wurde mithilfe von Plattierungseffizienz-Assays (efficiency of plating; EOP) untersucht. Es zeigte sich eine Reduktion der Infektionseffizienz bei PpiD-Deletionsmutanten, wobei die Plaquebildung auf etwa 80% des Wildtyps abnahm. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PpiD eine unterstützende, jedoch nicht essentielle Rolle bei der Phageninfektion spielt, die möglicherweise durch andere periplasmatische Chaperone ergänzt wird.
Der zweite Teil der Studie konzentrierte sich auf das Schwanzspitzenprotein gp27 und dessen Interaktion mit der inneren Membran. Gp27, ein trimeres Protein, das mit gp5 assoziiert ist, wird eine zentrale Rolle bei der Bildung eines Kanals für die DNA-Translokation zugeschrieben (Kanamaru et al., 2002). Um die Bindungspotenziale von gp27 an innere Membranproteine zu untersuchen, wurden T4-Phagenpartikel mit His-markiertem gp27 konstruiert und in vivo Cross-linking Experimente durchgeführt. Dabei wurden mehrere Wirtsproteine identifiziert, die mit gp27 interagieren, darunter DamX und PpiD. DamX, ein Protein, das an der Peptidoglykan-Umbildung und Stabilisierung des Zellteilungskomplexes beteiligt ist, wurde als zentraler Interaktionspartner von gp27 charakterisiert. Kreuzvernetzung und Affinitätsreinigung bestätigten diese Interaktion, und nachfolgende Infektionsassays zeigten eine Reduktion der Infektionseffizienz um bis zu 60% in DamX-Deletionsmutanten. Dies unterstreicht die essentielle Rolle von DamX bei der Erleichterung der Phagen-DNA-Translokation über die innere Membran. Es wird angenommen, dass DamX eine strukturelle oder funktionelle Plattform bereitstellt, die die Phagen-Wirts-Schnittstelle während der Infektion stabilisiert. Zusätzlich wurde PpiD erneut als Interaktionspartner identifiziert, was auf eine Beteiligung an mehreren Phasen des Infektionsprozesses hindeutet. Die Rolle von PpiD bei der Stabilisierung des Phagen an der inneren Membran oder bei der Vermittlung struktureller Übergänge, die für die DNA-Translokation erforderlich sind, bedarf weiterer Untersuchung. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass DamX und PpiD nicht nur für die initiale Bindung des Phagen entscheidend sind, sondern auch eine Rolle bei der Vermittlung der strukturellen Übergänge spielen, die für die erfolgreiche Translokation der Phagen-DNA erforderlich sind.
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2025-05-16
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Wenzel, S. (2025). Protein interactions between the bacteriophage T4 tail tip and the inner membrane of Escherichia coli. https://doi.org/10.60848/12675
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English
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Classification (DDC)
570 Biology
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Sustainable Development Goals
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author = {Wenzel, Sabrina},
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