Species of the Diaporthe/Phomopsis Complex (DPC) in European soybean and establishment of quadruplex Real-Time PCR for diagnosis

Abstract

Diaporthe seed decay is among the most disruptive soybean diseases around the world, which cause significant yield losses and affect soybean quality. Different Diaporthe species cause this disease, while Diaporthe longicolla is considered the main causal agent. The species of this fungal complex (genus Diaporthe is also called the Diaporthe/Phomopsis Complex / DPC) have to be accurately identified for epidemiological studies of the disease and for optimal control measures. To identify the major causal agents of seed decay in Europe, DPC-damaged soybean seeds of various cultivars, that were collected from different fields in Germany, France, and Austria were tested by seed plating. 32 Diaporthe isolates could be obtained. The isolates were morphologically identified by the colors and shape of the colony, conidia dimensions, and by whether pycnidia with α- and/or β-conidia or perithecia with ascospores are formed. To corroborate morphological identification, sequences of the internal transcribed spacer (ITS), translation elongation factor 1-α (TEF1), and beta-tubulin (TUB) sequences were obtained. From the results of both morphological and molecular analyses it became clear that all isolates belong to one of the four species D. longicolla, D. caulivora, D. eres, and D. novem. The pathogenicity of all strains on soybean was tested. Molecular phylogenies were calculated and based on the above results updated species descriptions were created. This study identified these four species as the main Diaporthe pathogens for soybean in central Europe. A sensitive and accurate method for quick detection of these pathogens was developed based on multiplex real-time PCR. Specific TaqMan primer-probe sets for the four species were designed based on TEF1 sequences. The primer-probe sets were tested for specificity and efficiency using PCR products and genomic DNA from the four Diaporthe species and several other soybean pathogens. These primer-probe sets reliably distinguish the different species and they can be used to detect them in the same reaction by quadruplex real-time PCR. DNA from different soybean plant materials including healthy and infected seeds or seed coats, stems, and leaves was used to test the quadruplex real-time PCR assay. Application of the assay was extended to quantify the pathogens. Standard curves for the four species were created from serial dilutions of genomic DNA diluted with DNA from soybean tissue. An additional standard curve was created from serial dilutions of soybean DNA diluted with ddH2O. To gain the ratio of fungal DNA per plant DNA (ng/ng), DNA samples from soybean tissues can now be examined in the new assay and a parallel SYBR® Green-based real-time PCR. The assay was first applied to six soybean seed lots with putative Diaporthe contamination. In all seed lots seeds contaminated with Diaporthe species and even some seeds infected with more than one Diaporthe species were found, while other seeds were free of the pathogens. The load of fungal biomass varies strongly between individual seeds.

Diaporthe seed decay (Diaporthe Samenverfall) ist eine der zerstörerischsten Sojabohnenkrankheiten, die weltweit die Qualität und Quantität der Samen beeinträchtigen. Die Krankheit wird hauptsächlich von Diaporthe longicolla zusammen mit anderen Diaporthe-Arten verursacht. Die genaue Identifizierung der Arten dieses Pilzkomplexes (die Gattung Diaporthe wird auch als Diaporthe/Phomopsis Komplex / DPK bezeichnet) ist notwendig, um die Epidemiologie der Krankheit zu verstehen und eine optimale Bekämpfung zu ermöglichen. Um die Hauptverursacher des Samenverfalls in Europa zu identifizieren, wurden DPK geschädigte Sojabohnensamen verschiedener Sorten, die von verschiedenen Feldern in Deutschland, Frankreich und Österreich stammen, durch „Seed Plating“ untersucht. 32 Diaporthe-Isolate konnten erhalten werden. Die Isolate wurden anhand von Farben und Wuchsformen der Kolonien, Abmessungen der Konidien, Existenz von α- und β-Konidien und Bildung von Perithezien identifiziert. Um die morphologische Identifizierung zu bestätigen, wurden Sequenzen des internen transkribierten Spacers (ITS), des Translationselongationsfaktors (TEF1) und des Beta-Tubulin (TUB) gewonnen. Durch Kombination der Ergebnisse der morphologischen und molekularen Analysen konnten die Isolate den vier Arten D. longicolla, D. caulivora, D. eres, und D. novem zugeordnet werden. Die Pathogenität aller Stämme auf Sojapflanzen wurde getestet. Molekulare Phylogenien wurden berechnet und basierend auf den obigen Ergebnissen wurden aktualisierte Artbeschreibungen erstellt. Als Ergebnis dieser Studie können diese vier Arten als die Hauptarten von Diaporthe an Sojabohnen in Mitteleuropa angesehen werden. Eine schnelle, sensitive und exakte Methode zum Nachweis dieser Pathogene basierend auf multiplex real-time PCR wurde entwickelt. Auf der Grundlage von TEF1-Sequenzen wurden vier artspezifische TaqMan Primer-Sonden Sets entwickelt. Die Spezifität und Effizienz der Primer-Sonden Sets wurden mit PCR-Produkten und genomischer DNA der vier Diaporthe Arten und einiger anderer Sojabohnen-Pathogene getestet. Diese Primer-Sonden Sets ermöglichen eine zuverlässige Unterscheidung der unterschiedlichen Arten und sie können verwendet werden, um die Arten mit der quadruplex real-time PCR parallel nachzuweisen. Darüber hinaus wurde der quadruplex real-time PCR Assay an verschiedenen Pflanzenmaterialien getestet, darunter gesunde und infizierte Sojasamen oder Samenschalen, Sojastängel und Blätter. Ebenfalls wurden die Voraussetzungen zur Nutzung der quadruplex real-time PCR für die Quantifizierung der Erreger geschaffen. Aus seriellen Verdünnungen genomischer DNA der Diaporthe-Arten, die mit DNA verdünnt wurden, die aus Sojabohnengewebe präpariert wurde, wurden Standardkurven erhalten. Eine zusätzliche Standardkurve wurde aus seriellen Verdünnungen von mit ddH2O verdünnter Sojabohnen-DNA erstellt. Um die Menge an Pilz DNA pro Pflanzen-DNA (ng/ng) zu quantifizieren, können nun DNA-Proben aus Sojabohnengewebe in dem neuen Assay und einer parallelen SYBR® Green-basierten real time PCR untersucht werden. Der Assay wurde mit DNA-Proben aus sechs Sojabohnen Samenchargen mit mutmaßlicher Diaporthe-Kontamination getestet. In allen Samenpartien waren Samen infiziert mit Diaporthe spp. und es wurden sogar einige Samen gefunden, die mit mehr als einer Diaporthe-Art infiziert waren, während andere Samen frei von den Pathogenen waren. Die Menge an Pilzbiomasse scheint zwischen einzelnen Samen sehr unterschiedlich zu sein.