Sequestration of plant toxins in milkweed bugs (Heteroptera: Lygaeinae) : physiological implications and mechanisms

Abstract

Insect herbivores and plants together are a crucial component of terrestrial macro-biodiversity. Within the realm of plant-insect interactions, phytophagy by insects triggered an “arms-race” dynamic resulting in escalatory adaptation and counter-adaptation over time. This coevolution led to complex phenomena such as sequestration of plant toxins by specialized insects, with the main aim to deter predators. Although sequestration is an extensively reported phenomenon, many physiological aspects and underlying mechanisms remain largely unexplored. Milkweed bugs (Heteroptera: Lygaeinae) constitute a versatile model ideally suited for studying both areas due to their particular evolutionary history. They are primarily associated with plant species in the Apocynaceae which commonly produce cardenolides, but remarkably some milkweed bug species secondarily evolved novel associations with phylogenetically disparate plant families supplying new sources of chemically related or unrelated toxins. Using as model milkweed bugs the cardenolide specialist Oncopeltus fasciatus and Spilostethus saxatilis, a species that shifted to sequestration of the chemically unrelated colchicoids, the present thesis first aimed to develop a new artificial diet that allowed the incorporation of the desired types and amounts of toxins without impairing insect performance. Taking a simplified approach, an artificial diet presented in a pill form and made of 100% organic sunflower meal was established. Despite the fact that the new diet has remarkable energy and nutrient differences with sunflower seeds (the laboratory diet), no differences in terms of insect performance were found between the two diets in O. fasciatus and S. saxatilis. Moreover, the new diet presented an acceptable concentration accuracy and shelf-life for short-term toxin feeding assays. Once established, the new diet was used to investigate the effects of cardenolides and colchicoids on several life-history traits of S. saxatilis, and to compare them with the effect of cardenolides in O. fasciatus. Although both classes of toxins have different molecular targets (cardenolides: Na+/K+-ATPase; colchicoids: tubulin), S. saxatilis was able to sequester them at a cost-free level. In fact, an increased performance was observed in O. fasciatus and an according trend was found in S. saxatilis after dietary exposure to cardenolides and colchicoids, respectively. Among cardenolides, labriformin is especially toxic for milkweed-specialist Na+/K+-ATPases in vitro. Nevertheless, it was shown to have no costs in terms of growth and fertility at the whole organism level for O. fasciatus. This finding might be an example of reciprocal evolution between milkweed plants and its herbivores, where highly toxic cardenolides specifically targeted to insect specialists are counteracted by tolerance, detoxification, and sequestration strategies. To assess the role of sequestration beyond normal physiological conditions, O. fasciatus and S. saxatilis were orally infected with the bacterium Pseudomonas entomophila. Neither cardenolides nor colchicoids provided a higher resistance or tolerance. Regarding mechanisms of sequestration, the other overarching research topic of the present thesis, both in vivo (whole animal) and in vitro (isolated digestive tracts) approaches showed no reciprocal competition for the same transport mechanism between chemically related and unrelated toxins. Furthermore, the digestive tract of milkweed bugs did not seem to be a critical mediator as it is for other non-sequestering and sequestering species. The time course of sequestration for the model species was resolved from three days to one hour, and the higher levels of colchicoids detected in S. saxatilis compared to the level of cardenolides in O. fasciatus might indicate an early acquisition of defenses with the shift from cardenolide to colchicoid-containing plants. Finally, a hint to preadaptation mechanisms to resist novel toxins was documented in Spilostethus pandurus, a species that belongs to the same genus as S. saxatilis, thereby providing a basis for future investigations.

Herbivore Insekten und Pflanzen stellen gemeinsam eine entscheidende Komponente der terrestrischen Makrobiodiversität dar. Innerhalb der Pflanzen-Insekten-Interaktionen verursacht insbesondere die Phytophagie bei Insekten eine „arms-race“ Dynamik, die im Laufe der Zeit zu einer Eskalierung der Anpassungs- und Gegenanpassungsstrategien führte. Diese Koevolution führt zu komplexen Phänomenen wie der Sequestrierung von Pflanzentoxinen durch spezialisierte Insekten, deren Hauptziel die Abschreckung von Räubern ist. Obwohl Sequestrierung ein gut dokumentiertes Phänomen ist, sind viele physiologische Aspekte und die zugrunde liegenden Mechanismen weitgehend unerforscht. Ritterwanzen (Heteroptera: Lygaeinae) stellen ein vielseitiges Modellsystem dar, das sich aufgrund der besonderen evolutionären Geschichte ideal für die Untersuchung beider Bereiche eignet. Ritterwanzen sind in erster Linie mit Pflanzenarten der Familie Apocynaceae (Hundsgiftgewächse) assoziiert, die häufig Cardenolide produzieren. Dennoch haben einige Ritterwanzen bemerkenswerterweise sekundär neue Assoziationen mit phylogenetisch unverwandten Pflanzenfamilien entwickelt, die neue Quellen für mit Cardenoliden chemisch-verwandte oder nicht-verwandte Toxine darstellen. Unter Verwendung des Cardenolid-Spezialisten Oncopeltus fasciatus, und Spilostethus saxatilis, einer Art, die zur Sequestrierung der chemisch nicht-verwandten Colchicoide übergegangen ist, als Modelle, zielte die vorliegende Dissertation zunächst darauf ab, eine neue künstliche Diät zu entwickeln, die die Darreichung der gewünschten Klassen von Toxinen in definierter Menge ermöglicht, ohne die Fitness der Wanzen per se zu beeinträchtigen. Unter Verwendung eines einfachen Ansatzes wurde eine künstliche Diät in Tablettenform aus 100% Sonnenblumenmehl entwickelt. Trotz der Tatsache, dass diese neue Diät bemerkenswerte Energie- und Nährstoffunterschiede zu Sonnenblumenkernen (der üblichen Aufzuchtdiät) aufweist, wurden zwischen den beiden Diäten bei O. fasciatus und S. saxatilis keine Unterschiede in Bezug auf die Fitness der Wanzen gefunden. Darüber hinaus wies die neue Diät eine akzeptable Konzentrationsgenauigkeit und Haltbarkeit für kurzzeitige Toxinfütterungsassays auf. Nach der Etablierung wurde die neue Diät verwendet um die Auswirkungen von Cardenoliden und Colchicoiden auf mehrere Life-history-Merkmale von S. saxatilis zu untersuchen und sie mit der Wirkung von Cardenoliden bei O. fasciatus zu vergleichen. Obwohl beide Toxinklassen unterschiedliche molekulare Targets haben (Cardenolide: Na+/K+-ATPase; Colchicoide: Tubulin), konnte S. saxatilis sie beide ohne Kosten sequestrieren. Tatsächlich wurde eine Leistungssteigerung bei O. fasciatus und ein entsprechender Trend bei S. saxatilis nach Exposition mit Cardenoliden bzw. Colchicoiden festgestellt. Innerhalb der Cardenolide ist Labriformin unter In-vitro-Bedingungen für die Na+/K+-ATPase von auf Seidenpflanzen (Asclepias) spezialisierten Ritterwanzen besonders toxisch. Dennoch konnte gezeigt werden, dass Labriformin bei O. fasciatus keine Kosten in Bezug auf Wachstum und Fruchtbarkeit auf der Ebene des gesamten Organismus verursacht. Dieser Befund könnte ein Beispiel für die wechselseitige Evolution zwischen Hundsgiftgewächse und ihren Pflanzenfressern sein, bei der hochgiftige Cardenolide, die speziell auf spezialisierte Insekten abzielen, durch Toleranz-, Entgiftungs- und Sequestrierungsstrategien bekämpft werden. Um die Rolle der Sequestrierung über normale physiologische Bedingungen hinaus zu beurteilen, wurden O. fasciatus und S. saxatilis oral mit dem Bakterium Pseudomonas entomophila infiziert. Weder Cardenolide noch Colchicoide lieferten eine höhere Resistenz oder Toleranz. In Bezug auf die Sequestrierungsmechanismen zeigten sowohl die in vivo (gesamter Organismus) als auch in vitro (isolierter Verdauungstrakt) Ansätze keine reziproke Konkurrenz für denselben Transportmechanismus zwischen chemisch-verwandten und nicht-verwandten Toxinen. Darüber hinaus schien der Verdauungstrakt von Ritterwanzen kein kritischer Mediator zu sein, wie es bei anderen nicht-sequestrierenden und sequestrierenden Arten der Fall ist. Der Zeitverlauf der Sequestrierung für die verwendeten Modellspezies wurde von drei Tagen bis auf eine Stunde aufgelöst. Die höheren Konzentrationen von Colchicoiden die in S. saxatilis nachgewiesen wurden im Vergleich zu der Konzentration von Cardenoliden in O. fasciatus, könnten auf eine frühe Abwehr hindeuten die mit der Verschiebung der Ernährung von Cardenolide zu colchicoidhaltigen Pflanzen einhergeht. Erste Hinweise auf Präadaptationsmechanismen zur Resistenz gegenüber neuartigen Toxinen wurde auch bei Spilostethus pandurus dokumentiert, einer Art die zur selben Gattung wie S. saxatilis gehört, was eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen liefert.