Weinblattmetabolite als Resistenzmarker für eine Plasmopara viticola Widerstandsfähigkeit

Abstract

Downy mildew of grapevine is one of the most important diseases of the European grapevine Vitis vinifera LINNÉ supsp. vinifera. It is caused by the obligate biotrophic oomycete Plasmopara viticola Berl. & De Toni. American grapevines are largely resistant to downy mildew and may contribute in to the protection of susceptible vines against P. viticola. Therefore, this work deals with the metabolite profiling of resistance markers (RM) from volatile secondary metabolites of susceptible and resistant grapevines. 10 genotypes with different resistance to P. viticola were analysed. 3 different Vitis species (V. vinifera, V. riparia, V. labrusca) and some hybrid vines were analysed. The constitutive markers of 3 developmental stages (BBCH6, BBCH8, BBCH9) were determined. In addition, induced markers were analysed. Furthermore, the relationship between leaf position and the occurrence of RM was investigated. The used metabolomic methods were also applied to identify markers for leaf position. For metabolite profiling the grape leaves were analysed using GC-MS and were evaluated using non-targeted and targeted analytical methods. The comparison of the metabolite profiles showed that the developmental stage has the strongest influence on the metabolite profile and the influence of the leaf position is so small that it can be neglected. A total of 41 constitutive RMs were identified. The metabolites identified came from the substance classes of green leaf volatiles (GLV), norisoprenoids, benzoate derivatives, monoterpenoids, a furan and a sesquiterpene. It was elaborated, that GLV, norisoprenoids, benzoate derivatives and 2-ethylfuran were almost exclusively present in higher concentrations in resistant genotypes. Monoterpenoids and the sesquiterpene calacorene were mainly detected in higher concentrations in the susceptible genotypes of V. vinifera. Furthermore, it could be shown, that monoterpenoids were detected in significantly increased concentrations at the developmental stage BBCH6 in the susceptible V. vinifera. calacorene was never detected in BBCH6. It was only found in significantly increased concentrations in the later developmental stages of V. vinifera. GLVs are RM in the resistant genotypes such as V. labrusca and occur here exclusively at the later developmental stages, mainly at BBCH9. For the constitutive RMs from the classes of norisoprenoids, benzoate derivatives and furan, no dependence of the developmental stages and their occurrence was observed. 3 other metabolites were identified as RMs that showed a strong correlation with the developmental stage. They appeared initially in BBCH6 in significantly increased concentrations in susceptible V. vinifera, but in BBCH9 they showed significantly increased concentrations in the resistant V. labrusca genotypes. These RMs with changing correlation were geranyl acetone, terpineol, and (Z)-3-hexenal. The correlation between occurrence of the constitutive RMs and the developmental stages has not been described before. It is a new finding of this work that monoterpenoids occur as RMs in grapevines mainly at BBCH6 and GLV as well as sesquiterpenes were found as RMs mainly at BBCH9. Norisoprenoids, benzoate derivatives and furan occurred as RMs at all developmental stages tested. Furthermore, terpenoids occurred species-specifically more frequently in V. vinifera as constitutive RMs, whereas the furan 2-ethylfuran never appeared as a RM in V. vinifera. Benzoate derivatives and GLVs were most frequently detected as RMs in V. labrusca genotypes. Norisoprenoids appeared most frequently, but not exclusively, as RMs in V. riparia. The correlation between the occurrence of norisoprenoids as RMs and species specificity to V. riparia is a new finding of this work. Nevertheless, it should be briefly mentioned, that this species specificity refers exclusively to the classification as a constitutive RM. Monoterpenes are also part of the metabolite profile of V. labrusca as well as norisoprenoids are important flavour compounds in quality wines. 24 induced RMs were determined. Most of the induced RMs occurred in the fungus-resistant cultivar Regent and only six induced RMs in the resistant V. labrusca hybrid Blue Isabella and in V. riparia. For all RMs identified, it was searched for reports on bioactivity in publications. For 2-ethylfuran, an isomer mix of (Z)- and (E)-ocimene as well as cyclocitral, an inhibitory effect on P. viticola has already been published. Still, 20 compounds have been associated here for the first time with a resistance response to P. viticola infection. These are theaspirane, (E)-damascone, (E)-damascenone, dihydroedulan I, megastigmatrienone, sulcatone, carvomenthenal A, nonanol , (Z)-3-hexenyl acetate, p-cymenene, p-cymene, limonene, alloocimene, myrcene, citronellol, hotrienol, (Z)-rose oxide, geranium oxide and calacorene.

Der Falsche Mehltau der Weinrebe ist eine der bedeutendsten Erkrankungen der europäischen Weinrebe Vitis vinifera LINNÉ subsp. vinifera. Er wird durch den obligat biotrophen Oomyceten Plasmopara viticola Berl. & De Toni hervorgerufen. Amerikanische Reben sind weitestgehend resistent gegen den Falschen Mehltau und könnten zum Schutz der anfälligen Reben auch gegen P. viticola beitragen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Metabolite profiling von Resistenzmarkern (RM) innerhalb der flüchtigen Sekundärmetabolite von anfälligen und resistenten Reben. Es wurden 10 Genotypen mit unterschiedlicher Resistenz gegen P. viticola analysiert. Es wurden 3 verschiedene Vitis Arten (V. vinifera, V. riparia, V. labrusca) und einige Hybridreben untersucht. Zunächst wurden die konstitutiven Marker von jeweils 3 Entwicklungsstadien (BBCH6, BBCH8 und BBCH9) ermittelt. Außerdem wurden induzierte Marker analysiert. Des Weiteren wurde der Zusammenhang zwischen der Blattposition und dem Auftreten von RM untersucht. Hierbei wurden mit den verwendeten Metabolomics-Methoden auch Marker für die Blattposition identifiziert. Für das Metabolite profiling wurden die Weinblätter mittels GC-MS analysiert und anschließend mit non-targeted und targeted Analysenmethoden ausgewertet. Es zeigte sich, dass das Entwicklungsstadium den stärksten Einfluss auf das Metabolitprofil hat und der Einfluss der Blattposition so gering ist, dass er vernachlässigt werden kann. Es konnten 41 konstitutive RM ermittelt werden. Die identifizierten Metabolite stammten aus den Stoffklassen der green leaf volatiles (GLV), Norisoprenoide, Benzoat-Derivate, Monoterpenoide, einem Furan und einem Sesquiterpen. GLV, Norisoprenoide, Benzoat-Derivate und 2-Ethylfuran lagen fast ausschließlich in den resistenten Genotypen in höherer Konzentration vor. Die Terpenoide lagen hauptsächlich in anfälligen Genotypen von V. vinifera in höherer Konzentration vor. Zudem wurden Monoterpenoide verstärkt im Entwicklungsstadium BBCH6 in signifikant höheren Konzentrationen in V. vinifera ermittelt. Wohingegen das Sesquiterpen α-Calacoren erst in den späteren Entwicklungsstadien in signifikant erhöhter Konzentration in V. vinifera ermittelt wurde. GLVs traten als RM in den resistenten Genotypen wie V. labrusca auf, hauptsächlich im Entwicklungsstadium BBCH9. Für die konstitutiven RM aus den Gruppen der Norisoprenoide, Benzoat-Derivate und Furan wurde keine Abhängigkeit des Entwicklungsstadiums beobachtet. Allerdings wurden drei weitere Metabolite als RM ermittelt, die eine starke Korrelation zum Entwicklungsstadium aufwiesen. Sie traten zunächst in BBCH6 in signifikant höheren Konzentrationen in V. vinifera und in BBCH9 in signifikant höheren Konzentrationen in V. labrusca auf. Diese RM mit wechselnder Korrelation waren die beiden Monoterpenoide Geranylaceton und Terpineol, sowie das GLV (Z)-3-Hexenal. Der Zusammenhang zwischen Auftreten der konstitutiven RM und Entwicklungsstadium ist bisher noch nicht beschrieben worden. Es ist eine neue Erkenntnis dieser Arbeit, dass Monoterpenoide als RM in Reben hauptsächlich in BBCH6 auftreten. GLV und Sesquiterpene wurden hauptsächlich in BBCH9 als RM ermittelt; wohingegen Norisoprenoide, Benzoat-Derivate und Furan zu allen getesteten Entwicklungsstadien als RM auftraten. Zudem traten Terpenoide artspezifisch häufiger in V. vinifera als konstitutive RM auf, wohingegen das Furan 2-Ethylfuran niemals in V. vinifera als RM in Erscheinung trat. Benzoat-Derivate und GLVs wurden am häufigsten in V. labrusca stämmigen Genotypen als RM detektiert. Norisoprenoide traten am häufigsten, aber nicht ausschließlich in V. riparia als RM in Erscheinung. Der Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Norisoprenoiden als RM und der Artspezifität zu V. riparia ist eine neue Erkenntnis dieser Arbeit. Dennoch soll hier kurz erwähnt werden, dass diese Artspezifität sich ausschließlich auf die Eingruppierung als konstitutive RM bezieht. Monoterpene sind auch Bestandteil des Metabolitprofils von V. labrusca und Norisoprenoide sind wichtige Geschmacksträger in Qualitätsweinen. Es konnten 24 induzierte RM ermittelt werden. Dabei stellte sich heraus, dass die meisten induzierten RM in der pilzwiderstandsfähigen Züchtung Regent auftraten und nur 6 in der resistenten V. labrusca-stämmigen Hybride Blaue Isabella und in V. riparia. Für alle ermittelten RM wurde nach beschriebener Bioaktivität recherchiert. Für 2-Ethylfuran, einem Isomeren-Mix aus (Z)- und (E)-Ocimen sowie Cyclocitral wurde bereits eine inhibierende Wirkung auf P. viticola publiziert. 20 Verbindungen wurden hier zum 1. Mal mit einer Resistenzantwort auf eine P. viticola Infektion in Verbindung gebracht. Dabei handelt es sich um Theaspiran, (E)-Damascon, (E)-Damascenon, Dihydroedulan I, Megastigmatrienon, Sulcaton, Carvomenthenal A, Nonanol, (Z)-3-Hexenylacetat, p-Cymen, p-Cymol, Limonen, Alloocimen, Myrcen, Citronellol, Hotrienol, (Z)-Rosenoxid, Geraniumoxid und Calacoren.