Molekulare und biochemische Charakterisierung von NEP1 - ähnlichen Proteinen (NLPs) aus Plasmopara viticola

Abstract

Plasmopara viticola, the causal agent of grapevine downy mildew is one of the most important diseases in viticulture and leads to significant losses in crop in years with beneficial weather conditions. The molecular processes during the interaction between this pathogen and vine are yet poorly understood. Adopted pathogens achieve an infection by avoidance or suppression of plant innate immunity. This suppression takes place through pathogen secreted effector molecules, which can modulate plant defense mechanisms in all kinds of ways. One of these effector families are the necrosis and ethylene inducing peptide 1 – like proteins (NLP). These proteins occur in a vast variety of microorganisms and can on the one hand act as virulence factors and on the other hand induce a broad spectrum of defense responses in plants. In necrotrophic or hemibiotrophic pathogens these proteins are formed when the organism starts to feed from dead plant material. Beside these cytotoxic proteins many non-cytotoxic NLPs are known from hemibiotrophic or biotrophic microorganisms. However, the particular function of these NLPs is so far unknown. To date NLPs from Hyaloperonospora arabidopsidis, causal agent of downy mildew on the model plant Arabidopsis thaliana, are the only known example for these proteins from an obligate biotroph plant pathogen. These NLPs are not able to induce necrosis and their roll during infection by the pathogen is so far unknown. During this work two NLPs of complete size as well as one truncated version were identified in the genome of the obligate biotrophic oomycete Plasmopara viticola. During further experiments these proteins had been characterized by the use of molecular biological and biochemical techniques. The studies revealed a high degree of conservation of the corresponding genes isolated from several resistant and susceptible grapevine cultivars. Gene expression analysis showed high PvNLP expression during early time points of infection and even before first contact with host plant material, respectively. Necrosis-inducing activity of PvNLPs was neither observed in the model plant Nicotiana benthamiana nor in different susceptible and resistant Vitis species. To further investigate the reasons for the non-cytotoxic character of these proteins several experiments were conducted to clarify the relevance of different structural regions, their affinity to form homo- and hetero oligomers, as well as their subcellular localization. The crucial component for the lack of cytotoxicity was not identified. Neither the presence of a signal peptide nor a Nterminal region from another NLP with cytotoxic characteristics were able to form a necrosis inducing fusion protein with one of the identified NLPs from P. viticola. Formation of homodimers was observed for PvNLPs in vitro, but apparently does not occur during expression in planta. Furthermore PvNLPs are localized in the cytoplasm of N. benthamiana cells and show a possible association with the plant cell nucleus. This pattern of subcellular localization was also observed for a NLP with necrosis-inducing activity. The ability to induce plant innate immunity in Vitis could not be attested, suggesting a possible lack of the corresponding receptor in this plant genus. The results of this work further suggest a different role of non-cytotoxic NLPs which in P. viticola may fulfill a function during early infection stages ranging from zoospore release until the successful penetration of the host plant Vitis vinifera.

Der Erreger des Falschen Mehltaus der Weinrebe, Plasmopara viticola, gehört zu den bedeutendsten Pathogenen im Weinbau und kann in Jahren mit für ihn günstiger Witterung zu erheblichen Ernteeinbußen führen. Die molekularen Vorgänge während der Interaktion des Pathogens mit der Weinrebe sind bisher nur wenig erforscht. Es ist bekannt, dass angepasste Pathogene eine Infektion durch die Umgehung oder Unterdrückung der angeborenen pflanzlichen Immunität erreichen. Diese Unterdrückung geschieht durch Effektoren, welche vom Pathogen sekretiert werden und auf verschiedenste Weise die Abwehrreaktion der Pflanze modulieren können. Eine solche Effektor-Familie sind z.B. die Nekrosen und Ethylen induzierendes Peptid 1 – ähnlichen Proteine (necrosis and ethylene inducing peptide 1 – like proteins, NLP), welche in den letzten Jahren in einer Vielzahl von Mikroorganismen beschrieben wurden. Diese Proteine können einerseits als Virulenzfaktoren eine Rolle spielen und andererseits zahlreiche pflanzliche Abwehrreaktionen induzieren. In nekrotrophen und hemibiotrophen Pflanzenpathogenen werden NLPs meist zu Zeitpunkten gebildet, in denen das Pathogen beginnt sich von abgestorbenem Pflanzenmaterial zu ernähren. Neben diesen cytotoxischen NLPs ist eine Vielzahl von nicht-cytotoxischen NLPs aus hemibiotrophen und biotrophen Mikroorgansimen bekannt. Welche Funktion diese NLPs haben, ist nicht bekannt. Proteine dieser Art sind bisher lediglich in einem obligat biotrophen Pflanzenpathogen, dem Falschen Mehltau der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, Hyaloperonospora arabidopsidis, beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurden im obligat biotrophen Oomyceten P. viticola zwei NLPs mit vollständigem Leserahmen sowie eine verkürzte Version identifiziert (PvNLPs) und mittels molekularbiologischer sowie biochemischer Methoden charakterisiert. Die Untersuchungen zeigten eine hohe Konservierung der entsprechenden Gene über verschiedene P. viticola Isolate von resistenten und suszeptiblen Rebsorten. Expressionsanalysen ergaben, dass PvNLPs zu frühen Zeitpunkten während der Infektion bzw. bereits vor dem ersten Pflanzenkontakt exprimiert werden. Eine Nekrosen induzierende Aktivität von PvNLP konnte weder in der Modellpflanze N. benthamiana, noch in verschiedenen, anfälligen oder resistenten Vitis spp. beobachtet werden. Zur Aufklärung der Ursachen für den Verlust der cytotoxischen Eigenschaften dieser Proteine wurde die Bedeutung verschiedener struktureller Bereiche, die Neigung zur Bildung von Homo- bzw. Hetero-Oligomerisierung, sowie die Lokalisation dieser Proteine auf subzellulärer Ebene untersucht. Was zum Verlust der Nekrosen induzierende Aktivität der Proteine führt, konnte nicht geklärt werden. Weder das Vorhandensein eines Signalpeptids noch das eines N-terminalen Bereichs aus einem anderen, cytotoxischen NLP führte in Fusionsproteinen mit den NLPs aus P. viticola zu Nekrosen induzierenden chimären Konstrukten. Homodimer-Bildung konnte für PvNLPs zwar im Reagenzglas nachgewiesen werden, scheint bei Expression in der Pflanze N. benthamiana jedoch nicht vorzuliegen. Weiterhin zeigte sich bei Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation eine Akkumulation im Cytoplasma sowie eine mögliche Assoziation mit dem Zellkern. Dieses Lokalisationsmuster unterscheidet sich nicht von dem eines cytotoxischen NLPs. Eine Rolle als Induktoren einer pflanzlichen Abwehrreaktion in Vitis konnte ebenso für keines der untersuchten NLPs nachgewiesen werden, was auf ein mögliches Fehlen des entsprechenden Rezeptors in Vitis hindeuten könnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass NLPs aus P. viticola während der Infektion der Weinrebe eine andere, bislang unbekannte Funktion erfüllen, welche hauptsächlich die frühen Infektionsstadien zu Zeitpunkten vom Schlupf der Zoosporen bis zur erfolgreichen Penetration der Weinrebe betrifft.