In vivo und molekularbiologische Untersuchungen zur Sensitivität von Phakopsora pachyrhizi gegenüber Demethylierungs-Inhibitoren und Qo-Inhibitoren

Abstract

Soybeans are one of the most important crops worldwide. Since 1980, soybean production attained increasing distinction in Brazil. Following the leading producer USA, Brazil counted as the second biggest soybean producer in 2010. A number of threats are involed reducing soybean yield, rating the Asian Soybean Rust, Phakopsora pachyhrizi, as one of the worst pathogens since its invasion in 2001. Until this date the American Soybean Rust, Phakopsora meibomiae, was known in Brazil only, which is of minor importance. Not only did P. pachyrhizi reduce soybean yield in Asia, but also in Brazil considerable additional costs were caused by yield reduction and disease management. Control is mainly based on fungicide treatment, demethylation inhibitors (DMI) and quinone outside inhibitors (QoI) being the most important and effective classes used. Both fungicide groups are frequently applied in combinations to ensure prolonged effects. While efficiency of QoIs remained unchanged, protection by DMIs was significantly narrowed. The primary objective of the recent study was to survey the sensitivity of P. pachyrhizi isolates towards fungicides and to analyse the genetical background of a conceivable adaption. Indeed, an adaption towards DMIs could be observed, while efficiency of QoIs was stable. Due to the P. pachyrhizi genetical structure of the cytochrome b (cyt b) gene, which corresponds to the QoI fungicide target protein, resistance towards QoIs based on the most important mechanism known from other pathogens is rather unlikely. The major resistance mechanism of phytopathogenic fungi against QoIs is an alteration of the cyt b-sequence, in particular point mutations F129L, G137R and G143A, whereas G143A results in highest resistance factors. An intron after codon 143 of the cyt b-gene prevents the development of G143A-mutation. In contrast, genetical analyses of the cyp51-gene, which corresponds to the target protein of DMI fungicides, revealed that adaption is based on different resistance mechanisms which have an additive or synergistic impact. In P. pachyrhizi, point mutations within the cyp51-gene and a modified expression of cyp51 were involved. An altered expression of cyp51 was due to a selective expression of a mutated cyp51-allele and due to up-regulation of cyp51. Six point mutations (F120L, Y131H, Y131F, K142R, I145F and I475T) which appeared in defined combinations, except for one mutation which was found as a single character, correspond to a reduced sensitivity. Additionaly, in some of the isolates cyp51 was up-regulated three- to thenfold compared to the reference strain, leading to decreased efficiency of DMIs. Indications were found, assuming that the copy number of the cyp51-gene in P. pachyrhizi is responsible for the observed alterations in the expression. Other resistance mechanisms than described in the recent study (such as expression of efflux transporters) may additionally play a role now or in future. Resistance towards DMIs evolved by P. pachyrhizi was caused by nesting mechanisms which appeared in quite a short time period due to enormous selection pressure by extensive DMI-use in large areas and the clonal, dicaryotic live cycle with short generation times. Thus, applications of fungicides with different modes of actions are recommended for management of P. pachyrhizi to prevent further resistance development and -distribution.

Weltweit gehört die Sojabohne zu einer der wichtigsten Kulturpflanzen. Nachdem die Bedeutung des Sojabohnenanbaus in Brasilien seit den 1980er Jahren zugenommen hat, war Brasilien 2010 der zweitgrößte Sojabohnenproduzent hinter den USA. Der Sojabohnenanbau wird durch eine Reihe von Schadfaktoren erschwert, von denen der Asiatische Sojabohnenrost, Phakopsora pachyrhizi, seit seiner Invasion im Jahr 2001 die größte Bedeutung hat. Bis zu diesem Zeitpunkt war in Brasilien nur der eher bedeutungslose Amerikanische Sojabohnenrost, Phakopsora meibomiae, bekannt. Wie auch in Asien, führte P. pachyrhizi in Brasilien zu enormen Ertragsausfällen bzw. zusätzlichen Kosten durch Kontroll-Maßnahmen. Um den Befall einzugrenzen und den Ertrag zu schützen, sind Fungizidapplikationen die wichtigste Maßnahme. Sowohl Demethylierungs-Inhibitoren (DMIs) als auch Quinone outside Inhibitoren (QoI) stellen dabei die bedeutsamsten und effizientesten Wirkstoffgruppen dar. Für einen möglichst langfristigen Schutz werden diese beiden Klassen häufig in Kombination angewandt. Während die Effizienz der QoIs unverändert geblieben ist, ließ die Wirksamkeit der DMIs bald nach. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Sensitivität von P. pachyrhizi gegenüber Fungiziden zu überprüfen und den genetischen Hintergrund für eine mögliche Adaptation zu analysieren. Dabei stellte sich heraus, dass eine Adaptation von P. pachyrhizi gegenüber DMIs besteht, während die QoIs nicht betroffen sind. Aufgrund der genetischen Struktur des cytochrom b (cyt b, Zielgen der QoIs) von P. pachyrhizi ist nicht zu erwarten, dass QoI-Resistenzen entstehen, wie sie von anderen Pathogenen bekannt sind. Die Punktmutationen F129L, G137R und G143A gelten als Hauptresistenzmechanismus von phytopathogenen Pilzen gegenüber QoIs, wobei die G143A Mutation zu den höchsten Resistenzfaktoren führt. Die Ausbildung einer G143A Mutation ist nur dann möglich, falls nach dem Codon 143 des cyt b-Gens kein Intron folgt. Im Gegensatz dazu offenbarten die molekularbiologischen Untersuchungen am cyp51, dem Zielgen der DMIs, dass verschiedene Resistenzmechanismen für die Adaptation gegenüber DMIs verantwortlich sind, die z. T. additiv bzw. synergistisch miteinander wirken. Dazu gehören Punktmutationen des cyp51, die Überexpression des cyp51 sowie die selektive Expression eines mutierten cyp51-Allels. Insgesamt wurden sechs Punktmutationen (F120L, Y131H, Y131F, K142R, I145F und I475T) gefunden, die mit einer verringerten Sensitivität gegenüber DMIs einhergehen und mit einer Ausnahme stets in bestimmten Kombinationen miteinander auftreten. Daneben bewirkte eine drei- bis zehnfache Überexpression des cyp51 verschiedener Isolate Unterschiede in der Sensitivität gegenüber DMIs. Es wurden Hinweise gefunden, dass die Kopienzahl des cyp51 im Genom von P. pachyrhizi einer der Mechanismen darstellen könnte, der für die Modifikation der cyp51-Expression verantwortlich ist. Da die Mutationsanalysen und die Ergebnisse zur Überexpression nicht alle Sensitivitätsverschiebungen erklären, sind außer den beschriebenen Resistenzmechanismen weitere Mechanismen (z. B. Expression von Effluxtransportern) zu vermuten. Die relativ schnelle Anpassung von P. pachyrhizi an DMIs und die Komplexität der zugrunde liegenden Resistenzmechanismen innerhalb eines Jahrzehnts lassen sich auf den enormen Selektionsdruck durch die Behandlung großer Flächen sowie den klonalen, dikaryotischen Lebenszyklus und der kurzen Generationsdauer zurückführen. Bei der Bekämpfung von P. pachyrhizi sollten daher zukünftig Fungizide mit verschiedenen Wirkmechanismen verwendet werden, um weitere Resistenzausbildung und deren Verbreitung zu vermeiden.