Physiological and ecological implications of sequestered cardenolides in the milkweed bugs (Heteroptera: Lygaeinae)

Abstract

Milkweed bugs (Heteroptera: Lygaeinae) have a predilection for toxic plants, and possess a distinctive black and red coloration. Although many milkweed bugs are generalist seed predators, they commonly feed on plants in the family Apocynaceae (milkweed) which often contain toxic cardenolides. Cardenolides inhibit the ubiquitous Na+/K+-ATPase, an essential animal enzyme mediating essential physiological functions. Milkweed bugs possess pronounced insensitivity towards cardenolides due to a few amino acid substitutions in the Na+/K+-ATPase (i.e., target site insensitivity) and sequester cardenolides for protection against their predators. The overarching question remains whether chemical defenses, in aposematic individuals sequestering toxins, incur physiological costs, such as effects on growth or other fitness parameters like longevity and fecundity, production of color pigments, and handling oxidative stresses, and/or ecological costs, such as universality of toxin defense. Using an artificial diet, I raised larvae of four milkweed bug species (Oncopeltus fasciatus, Caenocoris nerii, Spilostethus pandurus and Arocatus longiceps) and a closely related pyrrhocorid bug species (Pyrrhocoris apterus) on three increasing dietary doses of cardenolides, and assessed the increase in growth by recording the mass until adult. Additionally, I investigated the life-history parameters only in O. fasciatus. To understand if milkweed bugs exhibit honest signaling, using same artificial diet treatment, the color intensity of O. fasciatus was measured by taking photographs in each larval stage until adulthood. To understand if toxin sequestration in milkweed bugs imposes oxidative stress, biomarkers of oxidative stress was measured through biochemical assays for lipid peroxidation (malondialdehyde, or MDA), superoxide dismutase (SOD), and total glutathione content (GSH). To understand why protection against certain predators is not observed in all bug species although they feed on seeds containing cardenolides, I tested if the outcome of predator- prey interaction was mediated by the structural variation within the same class of compound or by the insect species. For this purpose, I raised two milkweed bug species (Lygaeus equestris and Horvathiolus superbus) on the seeds of two phylogenetically unrelated host plants (Ranunculaceae: Adonis vernalis and Plantaginaceae: Digitalis purpurea) from which the bugs sequestered cardenolides, and carried out predation assays with lacewing larvae. The amount of toxins sequestered by the milkweed bugs was estimated using high performance liquid chromatography. My research revealed that dietary plant toxins increased growth in the sequestering specialists (O. fasciatus and C. nerii) but not in the sequestering generalist, S. pandurus, despite all possessing toxin-resistant Na+/K+-ATPases. Under exposure to the dietary toxins, the growth of A. longiceps nymphs (resistant and non-sequestering) was unaffected, while that of P. apterus (non-resistant and non-sequestering) was impaired. In addition, O. fasciatus nymphs developed to adults faster and lived longer as adults under toxin exposure when compared to individuals raised on the control diet, but produced significantly fewer offspring unless being transferred to a toxin-free diet after reaching adulthood. Furthermore, I showed that O. fasciatus raised on the high and medium levels of dietary cardenolides had significantly lower levels of GSH. Bugs with more GSH levels had brighter warning signals but these signals were not related to sequestration. Besides physiological aspects, the chance of milkweed bugs surviving a predator attack strongly depended on the structural differences of sequestered toxins. Overall, I found that cardenolide consumption exerts a positive effect on overall fitness in milkweed bugs, a conclusion in disagreement with current theory predicting costs of sequestration. Oxidative state may be a fundamental aspect where costs lie in aposematic individuals sequestering toxins, and the effect of plant-toxin sequestration on predators is affected by the structural variation of defensive compounds and therefore depends on the ecological context, i.e., host-plant use. My dissertation provides insight into the implications of physiology and ecology on sequestering aposematic insects, giving us a better understanding of plant-insect-predator interactions.

Ritterwanzen (Heteroptera: Lygaeinae) sind haeufig generalistische Samenraeuber und weisen eine charakteristische schwarz-rote Faerbung auf. Die Wanzen bevorzugen Samen toxischer Pflanzen aus der Familie der Apocynaceae (Hundsgiftgewaechse). Diese enthalten Cardenolide, welche die ubiquitaer vorkommende Na+/K+-ATPase hemmen, die essenzielle physiologische Funktionen im tierischen Organismus einnimmt. Lygaeinae besitzen aufgrund einiger Aminosaeure-Substitutionen in der Na+/K+-ATPase eine ausgepraegte Resistenz gegenueber den toxischen Cardenoliden und sequestrieren diese zum Schutz vor Fressfeinden. Die uebergeordnete Fragestellung meiner Dissertation ist, ob die Sequestrierung von Toxinen bei aposematischen Vertretern der Lygaeinae physiologische (z. B. Wachstum, Lebensspanne, Fruchtbarkeit, Produktion von Farbpigmenten und Umgang mit oxidativem Stress) und oekologische Kosten (z. B. Universalitaet der Toxin vermittelten Abwehr) verursacht. Mithilfe einer artifiziellen Diaet, welche Cardenolide in drei ansteigenden Konzentrationen enthielt, zog ich Nymphen von vier Lygaeinae-Arten (Oncopeltus fasciatus, Caenocoris nerii, Arocatus longiceps und Spilostethus pandurus) und eine eng verwandte Feuerwanzenart (Pyrrhocoris apterus) bis zum Adultstadium auf. Das Wachstum wurde bei allen Arten durch Gewichtsanalysen verfolgt, weitere Fitnessparameter wurden nur fuer Oncopeltus fasciatus ermittelt. Farbintensitaet von O. fasciatus sowie oxidativer Stress wurden mittels Bildaufnahmen und biochemischen Methoden zum Nachweis von Lipidperoxidation (Malondialdehyd oder MDA), Superoxiddismutase (SOD) und Gesamtglutathiongehalt (GSH) in allen Nymphen-Stadien bis hin zum adulten Tier gemessen. Um zu verstehen, warum ein Schutz gegen bestimmte Praedatoren nicht bei allen Wanzenarten nach dem Verzehr herzglykosidhaltiger Samen beobachtet wird, untersuchte ich, ob das Ergebnis der Raeuber-Beute-Interaktion durch die strukturelle Variation innerhalb derselben Verbindungsklasse oder durch die Insektenspezies beeinflusst wurde. Dazu zog ich zwei Arten von Ritterwanzen (Lygaeus equestris und Horvathiolus superbus) auf Samen zweier phylogenetisch nicht verwandter Wirtspflanzen (Ranunculaceae: Adonis vernalis und Plantaginaceae: Digitalis purpurea) auf, deren Cardenolide die Wanzen sequestrierten und fuehrte Praedationsexperimente mit Florfliegenlarven durch. Die Menge an sequestrierten Toxinen habe ich mittels Hochleistungsfluessigkeitschromatographie erfasst. Meine Untersuchungen ergaben, dass die mit der Nahrung aufgenommenen Pflanzentoxine das Wachstum der sequestrierenden Nahrungsspezialisten (O. fasciatus und C. nerii), nicht aber das der sequestrierenden Nahrungsgeneralisten, S. pandurus, beschleunigten, obwohl sie alle Toxin resistente Na+/K+-ATPasen besitzen. Unter Toxin-Exposition war das Wachstum der A. longiceps Nymphen (resistent und nicht sequestrierend) unbeeinflusst, waehrend das der P. apterus (nicht resistent und nicht sequestrierend) beeintraechtigt war. Darueber hinaus erreichten O. fasciatus Nymphen unter Toxin-Exposition frueher das Adultstadium und lebten zudem laenger, als Individuen, die auf einer Kontroll-Diaet ohne Toxine aufgezogen wurden. Allerdings produzierten sie deutlich weniger Nachkommen, wenn sie nach Erreichen des adulten Stadiums nicht auf eine Toxin freie Diaet umgestellt wurden. Weitergehend konnte ich zeigen, dass jene O. fasciatus, welche auf Diaet mit hohen und mittleren Cardenolid- Konzentrationen aufgezogen wurden, deutlich geringere GSH-Werte aufwiesen. Wanzen mit hoeheren GSH-Werten zeigten leuchtendere Signalfarben, die jedoch nicht mit der Sequestrierung korrelierten. Neben physiologischen Aspekten hing die Wahrscheinlichkeit, ob Ritterwanzen den Angriff eines Fressfeindes ueberlebten, stark von den strukturellen Unterschieden der sequestrierten Toxine ab. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass Cardenolid-Konsum einen positiven Effekt auf die Gesamtfitness mancher Ritterwanzen hat, was im Widerspruch zur aktuellen Lehrmeinung steht, dass durch Sequestrierung physiologische Kosten verursacht werden. Der oxidative Zustand der Tiere weist dennoch auf potentielle physiologische Kosten der Toxin-Sequestrierung hin. Die Wirkung der Toxin-Sequestrierung auf Fressfeinde wird durch strukturelle Variationen der toxischen Verbindungen zur Abwehr beeinflusst, sie haengt daher vom oekologischen Kontext, sprich der Verwendung bestimmter Wirtspflanzen ab. Die vorliegende Dissertation gibt einen Einblick in die physiologischen und oekologischen Konsequenzen von Sequestrierung bei aposematischen Insekten und verhilft zu einem besseren Verstaendnis der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen, Insekten und Fressfeinden.