Phytate hydrolysis and formation of inositol phosphates in the digestive tract of broilers

Abstract

Phytate (any salt of myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis (dihydrogen phosphate) or InsP6) represents the major binding form of phosphorus (P) in plant seeds. In the digestive tract, availability of P from plant seeds and feedstuffs obtained thereof largely depends on the enzymatic hydrolysis of InsP6 and less phosphorylated inositol phosphate isomers (InsPs). High prices of mineral P supplements and environmental burden linked with excessive P excretion of animals as well as exhaustion of the global rock phosphate stores demand for maximization of phytate-P utilization in animal feeding. The major objective of this thesis was to understand better InsP6 hydrolysis and formation of lower InsPs in different segments of the digestive tract of broilers and how they can be influenced by different dietary factors. In the first study (Manuscript 1), broilers (n=10 pens per dietary treatment) were fed low-P (5.2 g/kg DM) corn-soybean meal-based diets without (basal diet) or with one of three different phytase supplements (an Aspergillus and two E. coli derived phytases) from days 16 to 25 of age. InsP6 hydrolysis until the lower ileum (74%) of birds fed the basal diet indicated a high potential of broilers and their gut microbiota to hydrolyse InsP6 in low-P diets. Different InsP pattern in different gut segments suggested the involvement of phosphatases of mucosal or microbial origin. Supplemented phytases significantly increased InsP6 hydrolysis in the crop but not in the lower ileum. Measurements in the crop and proventriculus/gizzard confirmed published in vitro degradation pathways of 3- and 6-phytases for the first time in broilers. Presence of InsP4 and InsP5 isomers specifically formed by different supplemented phytases indicated activity of these enzymes still in the small intestine. InsP4 accumulation differed between the 6- and 3-phytases in the anterior segments of the gut. In the second study (Manuscript 2), effects of supplemental mineral P were studied using different basal diets. Semi-synthetic and corn-soybean meal-based basal diets (experiment 1), or corn-based and wheat-based basal diets were used (experiment 2). Anhydrous monosodium phosphate (MSPa) or monocalcium phosphate monohydrate (MCPh) was supplemented to increment the P concentration by 0.05, 0.10, and 0.15% or by 0.075 and 0.150% in experiment 1 and 2, respectively. In experiment 1, total excreta were collected from day 20 to 24 of age (7 replicated birds per diet). In experiment 2, digesta from the terminal ileum was collected when broilers were 22 days old (5 replicated pens per diet, 19 birds per pen). No differences were found in InsP6 hydrolysis between the maize- and wheat-based diets (experiment 2). Mineral P supplements significantly decreased InsP6 hydrolysis from the InsP-containing diets in both experiments. The choice of the basal diet did not affect the evaluation of the supplemented mineral P sources. This lead to the conclusion that calculated availability values for mineral P sources need to be adjusted for the decline in hydrolysis of InsP contained in the basal diet resulting from the P supplement. In the third study (Manuscript 3), broilers (20 birds per pen; n=8 pens per treatment) were fed two low-P corn-soybean meal-based diets without (BD-; 4.4 g P/kg DM) or with monocalcium phosphate (MCP) (BD+; 5.2 g P/kg DM) and without or with added phytase at 500 or 12,500 FTU/kg from days 15 to 24 of age. Digesta samples were taken from the duodenum/jejunum and lower ileum. Another 180 broilers (n=6 pens per treatment, 10 birds each) were fed the three BD+ diets from day 1 to 21 of age to assess the influence of supplemented phytase on tibia mineralization and strength. Interactions between MCP and phytase affected InsP6 hydrolysis and the concentrations of specific lower InsPs. Supplementation with 12,500 FTU/kg phytase resulted in 92% prececal InsP6 hydrolysis and strong degradation of InsP5. This resulted in higher P net absorption, affirmed by higher body weight gain, tibia strength, and mineralization compared to treatments without or with 500 FTU/kg of phytase. MCP supplementation reduced InsP6 hydrolysis and the degradation of specific lower InsPs in birds fed diets without phytase or with 500 FTU/kg of phytase, but did not reduce InsP6 hydrolysis or degradation of InsP5 at the high phytase dose. Hence effects of added MCP on phytase efficacy depend on the dose of supplemented phytase. In the fourth study (Manuscript 4), broilers (15 birds per pen, n=8 pens per treatment) were fed a wheat-soybean meal diet low in P (4.8 g/kg DM) and containing either microwave-treated (BDTW; 121 U/kg of phytase) or non-microwave treated (BDUTW; 623 U/kg of phytase) wheat meal from d 16 to 23 of age. Diets were used without or with supplementation of a phytase, alone or in combination with a xylanase. Interactions between microwave treatment and enzyme supplementation were found for InsP6 hydrolysis in the ileum and P net absorption in the duodenum/jejunum and ileum. In the ileum, P net absorption was similar, but InsP6 hydrolysis was significantly higher for BDTW (78%) than for BDUTW (69%) in the absence of supplemental phytase. Microwaving may have disrupted wheat aleurone structures in ways that increased the accessibility of the phytate and may have encouraged higher levels of activity among specific phytases of microbial or endogenous mucosal origin in the lower small intestine. In both segments, InsP6 hydrolysis and P net absorption were significantly increased by supplementation of phytase, but no further by additional supplementation of xylanase. In birds that were fed the phytase-supplemented diets, microwave treatment of wheat had no effect on InsP6 hydrolysis, but it significantly reduced P net absorption in both segments. The fifth study compromised two experiments (Manuscript 5) in which the influence of different dietary factors on InsP6 degradation in the crop was investigated. The experimental designs was as mentioned for Manuscript 3 (experiment 2) and 4 (experiment 1) since the samples were taken in the same trials. In experiment 1, InsP6 hydrolysis in the crop was significantly increased by supplementation of phytase, but not further by the additional supplementation of xylanase. Microwave treatment of wheat reduced InsP6 hydrolysis and degradation of InsP5, due to reduction in intrinsic enzyme activity. The effect of 500 FTU/kg of supplemental phytase on InsP6 hydrolysis was much higher in broilers fed the maize- compared to those fed the wheat-based diets (experiment 2 and 1). Thus, for supplemental phytase the accessibility of phytate in wheat seems to be lower than in maize, perhaps due to different storage sites. Supplementation of 12,500 FTU/kg of phytase caused high InsP6 hydrolysis (up to 80%) and stronger degradation of InsP3-5 than supplementation of 500 FTU/kg (experiment 2). In both experiments, degradation of Ins(1,2,5,6)P4 was a limiting step in the breakdown process of InsP6 by the supplemented phytase. However, upon phytase supplementation Ins(1,2,5,6)P4 accumulated in BDTW diets whereas InsP4 degradation proceeded in untreated wheat diets (experiment 1). Ins(1,2,5,6)P4 seemed to be degraded synergistically by intrinsic wheat phosphatases and the supplemented phytase. Taking all studies together, it can be concluded that broilers and their gut microbiota have a very high potential to hydrolyze InsP6 in the digestive tract when diets low in P and Ca are fed. Differences in the concentrations of lower InsPs showed that the initial step of InsP6 hydrolysis is not the only catabolic step influenced by different dietary factors. To optimize efficacy of phytases and achieve a maximal InsP degradation and minimal P excretions the separate and interactive effects of different dietary influencing factors on InsP hydrolysis need to be better understood and considered in future diet formulations.

In pflanzlichen Samen liegt Phosphor (P) überwiegend in Form von Phytat (Salze von Myo-Inositol 1,2,3,4,5,6-Hexakisdihydrogenphosphat oder InsP6) vor. Daher hängt die P-Verfügbarkeit aus pflanzlichen Futtermitteln, die aus Samen hergestellt werden, im Verdauungstrakt hauptsächlich von der enzymatischen Hydrolyse von InsP6 und von niederen Inositolphosphat-Isomeren (InsPs) ab. Aufgrund der hohen Preise für mineralischen P, der ökologischen Relevanz übermäßiger P-Ausscheidungen sowie der Erschöpfung mineralischer P-Reserven gewinnen Erkenntnisse zur Maximierung der Verwertbarkeit von Phytat-P in der Geflügelernährung zunehmend an Bedeutung. Das Hauptziel dieser Arbeit war daher, die InsP6-Hydrolyse und die Bildung niederer InsPs in verschiedenen Abschnitten des Verdauungstraktes beim Broiler besser zu verstehen. Zudem wurde der Einfluss verschiedener Fütterungsfaktoren und deren Interaktionen untersucht. In der ersten Studie (Manuskript 1) wurden P-arme (5.2 g P/kg TM), auf Mais und Sojaextraktionsschrot basierende Rationen ohne (Basalration) oder mit Zulage einer von drei Phytasen (eine Aspergillus- und zwei E. coli-Phytasen) (16.-25. Lebenstag, n=10 Abteile pro Behandlung mit je 15 Broilern) eingesetzt. Die hohe InsP6-Hydrolyse (74%) bis zum Ende des Ileums der mit der Basalration gefütterten Tiere deutete auf ein hohes Potenzial des Broilers und dessen Mikrobiota zur InsP6-Hydrolyse hin. Unterschiedliche InsP-Muster zwischen den Abschnitten des Verdauungstraktes lassen auf die Beteiligung von Phosphatasen mukosaler und mikrobieller Herkunft schließen. Die Phytasezulage erhöhte die InsP6-Hydrolyse im Kropf, jedoch nicht im Ileum. Die Ergebnisse im Kropf und Drüsen-/Muskelmagen bestätigten die in der Literatur beschriebenen in vitro-Abbauwege von 3- und 6-Phytasen zum ersten Mal im Broiler. Im Dünndarm konnten die von den zugelegten Phytasen spezifisch gebildeten InsP4-5-Isomere noch vorgefunden werden, was auf ihre weitere Aktivität im Dünndarm schließen lässt. Die Akkumulation von InsP4 in den vorderen Abschnitten des Verdauungstraktes unterschied sich beim Einsatz von 3- und 6-Phytasen. In der zweiten Studie (Manuskript 2) wurde der Einfluss der Zulage von mineralischem P und von unterschiedlichen Basalrationen auf die Verfügbarkeit von mineralischem P bestimmt. Es wurden semisynthetische oder auf Mais und Sojaextraktionsschrot (Experiment 1) und auf Mais oder Weizen basierende Rationen (Experiment 2) eingesetzt. Um P-Konzentrationen von 0,05, 0,10 und 0,15% (Experiment 1) oder 0,075% und 0,15% (Experiment 2) zu erreichen wurden die Rationen mit wasserfreiem Mononatriumphoshat (MSPa) oder Monocalciumphosphat-Monohydrat (MCPh) ergänzt. Experiment 1 basierte auf Exkrementsammlungen (20. bis 24. Lebenstag, n=7 Tiere pro Ration), Experiment 2 auf Chymussammlungen (Ileum, 22 Tage alte Broiler, n=5 Abteile mit jeweils 19 Tieren). Die Weizen- und Mais-basierten Rationen unterschieden sich nicht in der InsP6-Hydrolyse. Jedoch reduzierte die Zulage von mineralischem P die InsP6-Hydrolyse beim Einsatz der InsP-haltigen Rationen. Die Evaluierung der zugelegten mineralischen P-Quelle wurde demnach nicht von der Wahl der Basalration beeinflusst. Allerdings sollten die für mineralische P-Quellen kalkulierten Werte um die durch die P-Zulage bewirkte Reduktion der InsP-Hydrolyse korrigiert werden. In der dritten Studie (Manuskript 3) wurden zwei P-arme auf Mais und Sojaextraktionsschrot basierende Rationen ohne (BD-; 4.4 g P/kg TM) oder mit Monocalciumphosphat (MCP) (BD+; 5.2 g P/kg TM) ohne oder mit Zulage von 500 oder 12.500 FTU/kg Phytase eingesetzt (15.-24. Lebenstag, 20 Broiler pro Abteil, n=8 Abteile pro Behandlung). Es wurden Chymusproben aus dem Duodenum/Jejunum und Ileum entnommen. Um die Wirkung zugelegter Phytase auf die Tibia-Mineralisierung zu untersuchen, wurden weitere 180 Broiler (n=6 Abteile pro Behandlung mit je 10 Tieren, 1.-21. Lebenstag) mit den drei BD+ Rationen gefüttert. Es traten Interaktionen zwischen MCP und Phytase bezüglich der InsP6-Hydrolyse sowie den Konzentrationen spezifischer niederer InsPs auf. Die Zulage von 12.500 FTU/kg Phytase ermöglichte eine InsP6-Hydrolyse von 92% sowie einen starken Abbau von InsP5. Zudem war die P-Nettoabsorption mit Zulage von 12.500 FTU/kg Phytase signifikant höher als ohne oder mit Zulage von 500 FTU/kg. Dies wurde durch eine höhere Lebendmassezunahme sowie durch eine höhere Tibia-Mineralisierung bestätigt. Unter der Verwendung der Rationen ohne oder mit 500 FTU/kg Phytase bewirkte die Zulage von MCP eine Reduktion der InsP6-Hydrolyse sowie einen reduzierten Abbau spezifischer niederer InsPs. Beim Einsatz von 12.500 FTU/kg Phytase hatte die Zulage von MCP keinen Einfluss auf die InsP6-Hydrolyse oder den Abbau von InsP5. Der Einfluss von zugelegtem MCP auf die Phytaseeffizienz hängt somit von der Phytasedosis ab. In der vierten Studie (Manuskript 4) wurden auf Weizen und Sojaextraktionsschrot basierende P-arme (4.8 g/kg TM) Rationen, welche entweder mikrowellenbehandelten (BDTW; 121 U/kg Phytase) oder nicht mikrowellenbehandelten Weizenschrot (BDUTW; 623 U/kg Phytase) enthielten, eingesetzt. Die Rationen wurden ohne oder mit Zulage einer Phytase allein oder in Kombination mit Xylanase verwendet (16.-23. Lebenstag, 15 Broiler pro Abteil, n=8 Abteile pro Behandlung). Zwischen der Mikrowellenbehandlung und der Enzymzulage traten Interaktionen bezüglich der InsP6-Hydrolyse im Ileum und der P-Nettoabsorption im Duodenum/Jejunum und Ileum auf. Ohne Enzymzulage war die InsP6-Hydrolyse im Ileum signifikant höher für BDTW (78%) verglichen mit BDUTW (69%), wohingegen die P-Nettoabsorption gleich war. Es ist anzunehmen, dass durch die Mikrowellenbehandlung Strukturen in der Aleuronschicht des Weizens zerstört wurden, was die Zugänglichkeit des darin vorkommenden Phytates erhöht haben könnte. Durch die Mikrowellenbehandlung könnte die Aktivität spezifischer mikrobieller und endogener Mukosaphytasen im Darm angestiegen sein. Die Phytasezulage erhöhte die InsP6-Hydrolyse und P-Nettoabsorption in beiden Abschnitten. Die Kombination mit Xylanase erzielte keine weitere Steigerung. Mit Enzymzulage wurde durch die Mikrowellenbehandlung die P-Nettoabsorption, nicht aber die InsP6-Hydrolyse, reduziert. Die letzte Studie umfasste zwei Experimente (Manuskript 5), die den Einfluss von Fütterungsfaktoren auf den InsP6-Abbau im Kropf untersuchten. Das Versuchsdesign entsprach dem in Manuskript 3 (Experiment 2) und 4 (Experiment 1) beschriebenen Design. In Experiment 1 erhöhte die Phytasezulage die InsP6-Hydrolyse. Die Kombination mit Xylanase erzielte keine weitere Steigerung. Infolge der reduzierten intrinsischen Phytaseaktivität wurden die InsP6-Hydrolyse und der Abbau von InsP5 durch die Mikrowellenbehandlung des Weizens vermindert. Die Steigerung der InsP6-Hydrolyse, die durch die Zulage von 500 FTU/kg Phytase erreicht wurde, war weitaus höher unter Verwendung der Mais- (Experiment 2) als unter Verwendung der Weizen-basierten Ration (Experiment 1). Demnach scheint das Phytat in Mais für die zugelegte Phytase besser zugänglich zu sein als das Phytat in Weizen, was auf die unterschiedlichen Speicherorte zurückzuführen sein kann. Mit Zulage von 12.500 FTU/kg Phytase wurde eine sehr hohe InsP6-Hydrolyse (bis zu 80%) sowie ein stärkerer Abbau von InsP3-5 als mit der Zulage von 500 FTU/kg Phytase erreicht (Experiment 2). Beide Experimente zeigten, dass der Abbau von Ins(1,2,5,6)P4 einen limitierenden Schritt beim InsP6-Abbau durch die zugelegte Phytase darstellt. Jedoch scheinen die zugelegte Phytase und Phosphatasen aus Weizen Ins(1,2,5,6)P4 synergistisch abzubauen, da die Phytasezulage eine Akkumulation von Ins(1,2,5,6)P4 bei BDTW, hingegen nicht bei BDUTW bewirkte (Experiment 1). Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lässt sich schlussfolgern, dass Masthühner zusammen mit ihrer Mikrobiota bei Verwendung von P- und Ca-armen Rationen ein hohes Potenzial zur InsP6-Hydrolyse im Dünndarm aufweisen. Unterschiede in den Konzentrationen niederer InsPs zeigten, dass die Abspaltung der ersten Phosphatgruppe beim InsP6-Abbau im Verdauungstrakt nicht der einzige katabole Schritt ist, der von verschiedenen Fütterungsfaktoren und deren Interaktionen beeinflusst wird. Um die Effizienz von Phytasen zu optimieren, einen maximalen InsP-Abbau zur erreichen, den P-Bedarf des Tieres exakter zu treffen und die P-Ausscheidungen zu minimieren müssen in zukünftigen Rationsgestaltungen der Einfluss dieser Faktoren sowie deren Interaktionen auf die InsP-Hydrolyse berücksichtigt werden.