Genotype specific responses to Bacillus spp. inoculation in lowland rice (Oryza sativa L.) under iron toxicity

Abstract

Amidst a growing global population, limited arable land, and higher pressure from both abiotic and biotic stressors in a shifting climate, there is a need for enhancing yields through sustainable agricultural practices, and new, more tolerant cultivars. In recent decades, employing microbial inoculants as biofertilizers and biopesticides has gained growing popularity. Yield reductions ranging from 16-78%, and sometimes complete crop failure, can occur in in lowland rice cultivation systems where high iron concentrations in the soil solution lead to excess iron uptake by the plants. Twenty to 60% of the rice growing area of sub-Saharan Africa is affected by iron toxicity. Development of iron-tolerant cultivars has lagged, largely due to gaps in understanding the genotypic adaptation mechanisms to this stress. Furthermore, effects of the microbiome on such stress responses are often overlooked. Although there have been previous reports on growth promoting effects of bacteria inoculation in lowland rice under iron toxicity, these studies were focused on plant growth promotion and mineral nutrient uptake. The primary aim of this dissertation was to assess the effects of Bacillus spp. inoculation on different lowland rice cultivars under iron toxicity, with emphasis on genotypic shoot tolerance strategies. Physiological, biochemical, and molecular mechanisms underlying genotypic responses to Bacillus inoculation were investigated and potential overlaps with responses to biotic stressors explored. Within the framework of this dissertation, three lowland rice cultivars, were inoculated with three Bacillus isolates (two B. pumilus isolates, one B. megaterium isolate) and exposed to 1000 ppm Fe2+ in the nutrient solution. The three cultivars were selected because they differ in their tolerance against iron toxicity, with one being sensitive, one a tolerant excluder (tolerance through minimizing iron uptake), and one a tolerant includer (tolerance of high iron concentrations in the plant). At day eight of stress exposure, the effects of Bacillus inoculation on tolerance against iron toxicity were evaluated by leaf symptom scoring. The effects of bacteria on the progression of leaf bronzing were then related to specific tolerance mechanisms, such as shoot iron content, iron allocation within the shoot, ROS scavenger enzyme activity, and the expression of genes related to iron toxicity tolerance. Furthermore, the effects of inoculation on brown spot disease development seven days after infection with Bipolaris oryzae were also assessed by leaf symptom scoring. All three Bacillus isolates were characterized for their ability to solubilize Zn and P, production of auxin, siderophores, and HCN, the presence of ACC deaminase activity, and in vitro inhibition of fungal growth. Effects of Bacillus inoculation on iron toxicity tolerance were found to depend on the cultivar x Bacillus isolate combination. While leaf symptom expression was ameliorated in the inoculated sensitive cultivar, the tolerant excluder cultivar generally developed stronger symptoms of iron toxicity when inoculated with Bacillus. No significant effects of Bacillus inoculation on the tolerance against iron toxicity were found in the tolerant includer cultivar. The beneficial outcomes of bacterial inoculation on plant stress tolerance are often credited to the bacteria's plant growth promoting properties. However, we did not find a clear association between plant growth and tolerance to iron toxicity. Furthermore, the Bacillus isolates did not display ACC deaminase activity nor the ability to solubilize Zn or P. Auxin production was only notable in B. megaterium, the isolate with least effects on both tolerance to iron toxicity and brown spot disease development. Siderophore production was found in B. pumilus D7.4 but only under low iron supply. Instead of plant growth, iron homeostasis as well as the interconnection between iron homeostasis and the immune response of lowland rice seem to be affected by bacterial inoculation. For the first time it was shown that Bacillus inoculation can directly affect tolerance against iron toxicity in lowland rice through inducing the production of ferritin in the young leaf blades of the sensitive cultivar. NO produced by B. pumilus Ni9MO12 is hypothesized to be involved in the signaling cascade leading to OsFER expression. Activity of ROS scavenger enzymes of the ascorbate-glutathione redox cycle were not affected by Bacillus inoculation in the leaf blades. In the tolerant excluder cultivar, an alteration in iron distribution within the shoot of B. pumilus Ni9MO12 inoculated plants, is assumed to cause the decline in tolerance. In conclusion, it was shown that Bacillus inoculation can influence iron toxicity tolerance in lowland rice. The results underline the significance of the interaction between rice genotypes and bacteria isolates. Furthermore, Bacillus inoculation did not promote plant growth, instead, distinct adaptation mechanisms within the shoot tissue were triggered to allow for increased tolerance of high iron concentrations in the leaves. The signaling cascades involved might be linked with biotic stress responses. Understanding such intricate mechanisms is vital for improving plant productivity. While inoculants composed of single microbial isolates may not meet the anticipated outcomes for practical application in sustainable agriculture, they offer a valuable laboratory tool for investigating genotypic plant tolerance to various abiotic and biotic stresses and the role of the microbiome within. New breeding approaches that consider genotypic traits essential for obtaining a beneficial microbiome might accelerate the creation of more tolerant cultivars.

Angesichts der wachsenden Weltbevölkerung, der begrenzten Anbauflächen und des zunehmenden Drucks durch abiotische und biotische Stressfaktoren in einem sich wandelnden Klima besteht die Notwendigkeit, die Erträge durch nachhaltige landwirtschaftliche Praktiken und neue, tolerantere Sorten zu steigern. In den letzten Jahrzehnten hat der Einsatz von mikrobiellen Inokulanten als Biodünger und Biopestizide an Popularität gewonnen. In Anbaugebieten von Nassreis, in denen hohe Eisenkonzentrationen in der Bodenlösung zu einer übermäßigen Eisenaufnahme durch die Pflanzen führen, kann es zu Ertragseinbußen zwischen 16 und 78 % und manchmal zu einem vollständigen Ernteausfall kommen. Zwanzig bis 60 % der Reisanbauflächen in Afrika südlich der Sahara sind von Eisentoxizität betroffen. Die Entwicklung eisentoleranter Reissorten erfolgt nur langsam, was vor allem auf das mangelnde Verständnis der genotypischen Anpassungsmechanismen an diesen Stress zurückzuführen ist. Außerdem werden die Auswirkungen des Mikrobioms auf di pflanzliche Stressreaktionen oft übersehen. Es gibt zwar frühere Berichte über wachstumsfördernde Wirkungen der Inokulation mit Bakterien in Nassreis unter Eisentoxizität, doch konzentrierten sich diese Studien auf die Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und die Aufnahme von Mineralstoffen. Das Hauptziel dieser Dissertation war es, die Auswirkungen der Inokulation mit Bacillus spp. auf verschiedene Nassreissorten unter Eisentoxizität zu bewerten, wobei der Schwerpunkt auf genotypischen Spross-Toleranzstrategien lag. Die Mechanismen, die den genotypischen Reaktionen auf die Bacillus-Inokulation zugrunde liegen, wurden untersucht und mögliche Überschneidungen mit den Reaktionen auf biotische Stressfaktoren erforscht. Im Rahmen dieser Dissertation wurden drei Nassreissorten mit drei Bacillus-Isolaten (zwei B. pumilus-Isolate, ein B. megaterium-Isolat) beimpft und 1000 ppm Fe2+ in der Nährlösung ausgesetzt. Die drei Sorten wurden ausgewählt, weil sie sich in ihrer Toleranz gegenüber Eisentoxizität unterscheiden, wobei eine Sorte empfindlich ist, eine Sorte ein toleranter „Excluder“ (Toleranz durch Minimierung der Eisenaufnahme) und eine Sorte ein toleranter „Includer“ ist (Toleranz gegenüber hohen Eisenkonzentrationen in der Pflanze). Am achten Tag der Stressexposition wurden die Auswirkungen der Bacillus-Inokulation auf die Toleranz gegenüber der Eisentoxizität durch eine Bonitur der Blattsymptome analysiert. Die Auswirkungen der Bakterien auf das Fortschreiten der Symptomentwicklung wurden dann mit spezifischen Toleranzmechanismen in Verbindung gebracht, wie z.B. dem Eisengehalt des Sprosses, der Eisenverteilung innerhalb des Sprosses, der Aktivität von Enzymen zum Abfangen von Sauerstoffradikalen und der Expression von Genen, die mit der Toleranz gegenüber Eisentoxizität zusammenhängen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen der Inokulation auf die Entwicklung der Braunfleckenkrankheit sieben Tage nach der Infektion mit Bipolaris oryzae anhand der Bewertung der Blattsymptome beurteilt. Alle drei Bacillus-Isolate wurden auf ihre Fähigkeit zur Solubilisierung von Zn und P, die Produktion von Auxin, Siderophoren und HCN, das Vorhandensein von ACC-Deaminase-Aktivität und die in-vitro Hemmung des Pilzwachstums untersucht. Die Auswirkungen der Bacillus-Inokulation auf die Eisentoxizitätstoleranz hingen von der Kombination Reissorte x Bacillus-Isolat ab. Während sich die Ausprägung der Blattsymptome bei der inokulierten sensitiven Sorte verringerte, entwickelte die tolerante „Excluder“- Sorte im Allgemeinen stärkere Symptome der Eisentoxizität, wenn sie mit Bacillus beimpft wurde. Bei der toleranten “Includer”-Sorte wurden keine signifikanten Auswirkungen der Bacillus- Inokulation auf die Toleranz gegenüber Eisentoxizität festgestellt. Die positiven Auswirkungen der bakteriellen Inokulation auf die Stresstoleranz der Pflanzen werden häufig auf die wachstumsfördernden Eigenschaften der Bakterien zurückgeführt. Wir konnten jedoch keinen eindeutigen Zusammenhang zwischen Pflanzenwachstum und Toleranz gegenüber Eisentoxizität feststellen. Darüber hinaus zeigten die drei Bacillus-Isolate weder ACC- Deaminase-Aktivität noch die Fähigkeit, Zn oder P zu solubilisieren. Auxinproduktion war nur bei B. megaterium deutlich vorhanden, dem Isolat mit den geringsten Auswirkungen auf die Toleranz gegenüber Eisentoxizität und die Entwicklung der Braunfleckenkrankheit. Produktion von Siderophoren wurde bei B. pumilus D7.4 festgestellt, allerdings nur bei geringer Eisenversorgung. Anstelle des Pflanzenwachstums scheinen der Eisenhaushalt sowie die Verbindung zwischen Eisenhaushalt und der Immunantwort von Nassreis durch die bakterielle Inokulation beeinflusst zu werden. Zum ersten Mal wurde gezeigt, dass die Inokulation mit Bacillus die Toleranz gegenüber Eisentoxizität bei Nassreis direkt beeinflussen kann, indem die Produktion von Ferritin in den jungen Blattspreiten der sensitiven Sorte angeregt wird. Es wird angenommen, dass das von B. pumilus Ni9MO12 produzierte NO an der Signalkette beteiligt ist, die zur OsFER-Expression führt, während die Aktivität der Enzyme des Ascorbat- Glutathion-Redoxzyklus in den Blattspreiten durch die Bacillus-Inokulation nicht signifikant beeinflusst wurde. Bei der toleranten Excluder-Sorte wird eine Veränderung der Eisenverteilung im Spross der mit B. pumilus Ni9MO12 inokulierten Pflanzen als Ursache für den Rückgang der Toleranz angenommen. Abschließend wurde gezeigt, dass die Bacillus-Inokulation die Toleranz gegenüber Eisentoxizität bei Nassreis beeinflussen kann. Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Wechselwirkung zwischen Reisgenotypen und Bakterienisolaten. Darüber hinaus förderte die Bacillus-Inokulation nicht das Pflanzenwachstum, sondern es wurden verschiedene Anpassungsmechanismen im Sprossgewebe ausgelöst, die eine erhöhte Toleranz gegenüber hohen Eisenkonzentrationen in den Blättern ermöglichen. Die beteiligten Signaltransduktionsketten überlappen möglicherweise mit denen biotischer Stressantworten. Das Verständnis solch komplizierter Mechanismen ist für die Verbesserung der Pflanzenproduktivität von entscheidender Bedeutung. Auch wenn Inokulate, die aus einzelnen mikrobiellen Isolaten bestehen, möglicherweise nicht die erwarteten Ergebnisse für die praktische Anwendung in der nachhaltigen Landwirtschaft liefern, bieten sie doch ein wertvolles Instrument für die Untersuchung der genotypischen Pflanzentoleranz gegenüber verschiedenen abiotischen und biotischen Stressfaktoren und der Rolle des Mikrobioms darin. Neue Züchtungsansätze, die genotypische Merkmale berücksichtigen, die für den Aufbau eines vorteilhaften Mikrobioms wesentlich sind, könnten die Entwicklung toleranterer Sorten beschleunigen.