Powerful proteins : structure and function of catalytic subunits of electrogenic NADH:quinone oxidoreductases

Abstract

Electrogenic NADH:quinone oxidoreductases are large, membrane-embedded enzyme complexes found in the respiratory chain of prokaryotes and the mitochondria of eukaryotes. They represent the first module of the oxidative phosphorylation system which converts the energy from nutrients into an electrochemical gradient by coupling redox reactions to the translocation of cations across membranes. A long chain of events, such as the synthesis of ATP, ion homeostasis, reactive oxygen species production and bacterial motility depend on the activity of these complexes. Complex I consists of up to 45 subunits and can be found in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes and in prokaryotes, where it is called NDH I. We investigated the isolated, hydrophobic ND5 subunit, which shows homologies to cation/proton antiporters, from human or Yarrowia lipolytica complex I. In vivo and biochemical analyses provided data on the cation translocation function and the alteration of function by disease-associated mutations. Taken together with the recently published 3D structure of bacterial complex I, these data allowed us to demonstrate that the ND5 subunit could possibly act as an antiporter module of mitochondrial complex I. Sodium ion translocating NADH:quinone oxidoreductase (Na+-NQR) is an enzyme found in many pathogenic bacteria. It consists of six subunits (NqrA - NqrF) whose 3D structures and enzymatic mechanisms were not known in detail at the time this project was initiated. By using high-resolution X-ray structures and site-directed mutagenesis, combined with biochemical studies, we proposed a model for catalysis and substrate selectivity on the atomic level of the electron input module of the complex, the NADH oxidizing domain of subunit NqrF. Furthermore, we analyzed the binding of silver ions to a cysteine residue in the NADH binding pocket and found that it leads to the inhibition of the Na+-NQR and to the killing of Vibrio cholerae in the nanomolar range. Subunit NqrA forms part of the quinone reductase module. By the use of physicochemical and biochemical methods we identified the herbicide 2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone (DBMIB) as a quinone antagonist and inhibitor of the Na+-NQR complex and discovered two adjacent quinone binding sites on NqrA.

Elektrogene NADH:Chinon Oxidoreduktasen sind grosse, in die Membran eingebettete Enzym-Komplexe der Atmungskette von Prokaryoten und Eukaryoten. Sie repräsentieren das erste Modul der oxidativen Phosphorylierung, welche die Energie aus Nährstoffen in einen elektrochemischen Gradienten wandelt, indem Redox-Reaktionen an den Transport von Kationen über eine Membran gekoppelt werden. Eine lange Kette an Abläufen in der Zelle hängt von der Aktivität dieser Komplexe ab, so z.B. die Synthese von ATP, Ionen-Homöostase, Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und Motilität von Bakterien. Komplex I besteht aus bis zu 45 Untereinheiten und findet sich in der inneren Mitochondrienmembran von Eukaryoten und in Prokaryoten, wo er als NDH I bekannt ist. Wir haben die isolierte, hydrophobe ND5 Untereinheit des Komplex I vom Menschen und der Hefe Yarrowia lipolytica untersucht, welche Homologien aufweist zu Kationen/Protonen Antiportern. In vivo und biochemische Analysen ermöglichten die funktionelle Untersuchung der Kationen-Translokation und der Veränderung der Funktion durch Krankheits-assoziierte Mutationen. Zusammen mit der kürzlich publizierten 3D Struktur des bakteriellen Komplex I haben es uns diese Daten erlaubt zu zeigen, dass die ND5 Untereinheit als Antiporter im mitochondriellen Komplex I fungieren könnte. Die Na+-translozierende NADH:Chinon Oxidoreduktase (Na+-NQR) wird häufig in pathogenen Bakterien vorgefunden. Sie besteht aus sechs Untereinheiten (NqrA - NqrF), deren 3D Struktur und Funktion zu Beginn dieses Projekts nicht im Detail bekannt waren. Durch hochauflösende Röntgen-Kristallstrukturen und ortsgerichtete Mutagenese sowie mittels biochemischen Methoden ist es uns gelungen, auf der atomaren Ebene ein Modell für die Katalyse und die Substratselektivität des Elektroneninput-Moduls, der NADH oxidierenden Domäne der Untereinheit NqrF, zu generieren. Wir haben weiterhin die Bindung von Silberionen an ein Cystein der NADH-Bindetasche analysiert und festgestellt, dass nanomolare Konzentrationen von Ag+ durch diese Bindung zur Hemmung der Na+-NQR und zum Abtöten von Vibrio cholerae führen. Die Untereinheit NqrA bildet einen Teil des Chinon- reduzierenden Moduls. Durch physikochemische und biochemische Untersuchungen konnten wir das Pflanzenschutzmittel 2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinon (DBMIB) als Antagonisten zu Chinon und Inhibitor der Na+-NQR identifizieren, sowie zwei nebeneinanderliegende Chinon-Bindestellen auf NqrA charakterisieren.